多形擬桿菌SYBR Green 熒光定量PCR 檢測方法的建立及應(yīng)用

朱亞麗，張廣智，趙圣國，梁 琳，亓玉卓,3，王明艷，崔尚金*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)北京科學觀測實驗室，北京 100193；3.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東青島 266109）

多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron，B.the taiotaomicron）屬于擬桿菌門/ 擬桿菌綱/ 擬桿菌目/擬桿菌科/擬桿菌屬，是一種嚴格厭氧的革蘭氏陰性菌。研究表明，B.thetaiotaomicron約占人腸道中所有細菌的6%，占擬桿菌的12%左右[1]。據(jù)基因組學研究表明，B.thetaiotaomicron能夠參與調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫和營養(yǎng)物質(zhì)代謝等多種生理功能，尤其在多糖降解方面[2]。研究發(fā)現(xiàn)，B.thetaiotaomicron是一種高度適應(yīng)的糖化菌，僅有的6.26 Mb 基因組（核內(nèi)染色體的基因組）編碼出163 種利用淀粉的蛋白，226 種糖苷水解酶和15種多糖裂解酶[3]，其在代謝多糖過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物還可為宿主提供營養(yǎng)，這一作用對家畜養(yǎng)殖有重大意義，特別在控制豬瘦肉率上具有一定的研究價值。此外，斷奶仔豬的腹瀉常常引起腸道菌群嚴重失調(diào)，若使用大量藥物，更可能破壞仔豬的腸道微生態(tài)平衡。B.thetaiotaomicron可恢復(fù)腸道的微生態(tài)，使有益菌群快速增殖從而改善腸道功能，可能是解決腹瀉問題的一種新方法[4]。因此，建立實驗室B.thetaiotaomicron檢測方法顯得尤為重要。相較于普通PCR，實時定量熒光PCR 具有敏感性高、特異性強、操作簡單等諸多突出優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細菌和病毒的檢測，如結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、炭疽桿菌（Bacillus anthracis）、沙門氏菌（Salmoninarum）、新城疫病毒（Νewcastle disease virus）、豬瘟病毒（Swine fever virus）等病原體的檢測[5-7]。因此，本研究旨在建立B.thetaiotaomicron實時熒光定量PCR 檢測方法，為B.thetaiotaomicron的定量檢測奠定一定的實驗室基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器 多形擬桿菌（標準株）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC，菌種保藏號As 1.5132）。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）、地中海擬桿菌（Bacteroides mediterraneensis）、擬桿菌菌株（Bacteroides vulgatus）均由本實驗鑒定保藏。試驗儀器為QuantStudio 7 Flex 熒光定量PCR 儀。SYBR qPCR Master Mix 購自諾唯贊生物制品有限公司。pEASY?-Blunt Cloning Kit 試劑盒購自全式金科技有限公司。瓊脂糖凝膠DΝA 回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。糞便基因組提取試劑盒、細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成 參照相關(guān)文獻[8]和GenBank 上已發(fā)表的B.thetaiotaomicron序列AE015928.1，針對16S rDΝA 序列，采用Oligo6.0 軟件，遵守引物設(shè)計原則。設(shè)計出1 對特異性引物AE01-F/R（AE01-F：5'-TAATCCAGACGGTGCCTGC-3'；AE01-R：5'-GCA TGGTGTTATTGGAATTG GAGC-3'），擴增條帶為178 bp。引物由華大基因科技有限公司合成。

1.3B.thetaiotaomicron細菌基因組DΝA 提取挑取B.thetaiotaomicron單個菌落接種于6 mL 胨酵母浸膏葡萄糖（PYG）液體培養(yǎng)基，37℃，靜置厭氧培養(yǎng)24 h。取B.thetaiotaomicron菌液4 mL，12 000 r/min 離心2 min 后棄上清，然后嚴格按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行操作。

1.4 引物特異性檢驗 使用B.thetaiotaomicron特異性引物AE01 進行普通PCR 反應(yīng)，50 μL PCR 反應(yīng)體系：Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL（濃度為10 μmol/L），模板DΝA 2 μL，加dd H2O 補足50 μL。PCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 3 min；變性94℃ 40 s；退火59℃ 30 s，延伸72℃ 40 s，30 個循環(huán)；終末延伸72℃ 5 min，于4℃終止反應(yīng)，保存?zhèn)溆?。? μL PCR 產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察結(jié)果。

1.5 標準陽性模板的制備 以B.thetaiotaomicron全基因組DΝA 為模板，按照1.4 中反應(yīng)體系和程序進行普通PCR 反應(yīng)，將PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DΝA 回收試劑盒回收純化后，與pEASY?-Blunt Cloning 載體連接，加連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于Trans1-T1 感受態(tài)細胞中，經(jīng)PCR鑒定和限制性酶切分析為陽性克隆后，將陽性質(zhì)粒送至華大股份科技有限公司進行測序，獲得pEASY?-B.thetaiotaomicronAE01 陽性質(zhì)粒。使用微量核酸測定儀對重組質(zhì)粒標準品的濃度和純度進行測定。然后根據(jù)質(zhì)粒濃度換算成拷貝數(shù)，拷貝數(shù)=（質(zhì)粒濃度×阿伏伽德羅常數(shù)）/（1 個堿基對的平均分子質(zhì)量×總長度）。將質(zhì)粒標準品置于-80℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 標準曲線的建立 將1.5 中制備的AE01 質(zhì)粒標準品進行10 倍梯度稀釋，取1.1×102～1.1×1011copies/μL 稀釋度的質(zhì)粒標準品，每個梯度設(shè)置3 個重復(fù)，以此作為陽性模板進行熒光定量PCR 反應(yīng)[9]。反應(yīng)體系：SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（濃度為10 μmol/L）各0.5 μL，模板DΝA 1 μL，加dd H2O 補足20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s；59℃退火30 s；72℃延伸30 s；40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過對不同梯度的標準陽性模板熒光曲線形狀及各濃度與熒光曲線ct 值相關(guān)性的大小確定檢測體系的線性范圍，并生成標準曲線[10]。

1.7 特異性試驗 提取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、植物乳桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、地中海擬桿菌和擬桿菌副生菌株等腸道細菌的全基因組DΝA。進行熒光定量PCR，反應(yīng)體系和條件參照1.6。

1.8 敏感性試驗 使用1.5 中制備的pEASY?-AE01 質(zhì)粒標準品進行10 倍梯度稀釋，以1.1×102～1.1×1011copies/μL 為模板進行敏感性試驗，各稀釋梯度按1.6中反應(yīng)體系和條件進行熒光定量PCR 反應(yīng)[11]。同時，用1.1×102～1.1×1011copies/μL 進行普通PCR 反應(yīng)，比較兩者的敏感性[12]。

1.9 重復(fù)性試驗 取1×108、1×107、1×106、1×105copies/μLpEASY?-AE01 質(zhì)粒標準品為模板，每個梯度設(shè)置3 個重復(fù)，進行熒光定量PCR 反應(yīng)。根據(jù)檢測結(jié)果分析各個濃度和重復(fù)的ct 值，計算組內(nèi)標準差和變異系數(shù)。

1.10 小鼠糞便樣品中B.thetaiotaomicron的測定 12 只6周齡、雄性 C57BL/6J、SPF 級小鼠，分為試驗組和對照組，每組6 只，其中試驗組給小鼠灌胃0.2 mL 109CFU/mLB.thetaiotaomicron，對照組灌胃0.2 mL 培養(yǎng)基，每周2～3次。灌胃2 周后，采集小鼠糞便12 份，每份稱取約0.2 g。提取小鼠糞便中細菌的全基因組DΝA，以此為模板，利用本研究中建立的SYBR Green 熒光定量PCR 方法進行檢測，評估其實用性。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性 利用特異性引物AE01 對B.thetaiotaomicron目的基因進行PCR 擴增后，PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示目的條帶只有1 條，大小為178 bp 左右，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

圖1 B.thetaiotaomicron AE01 目的條帶擴增

2.2 標準陽性質(zhì)粒的制備 利用M13 Forward Primer 和M13 Reverse Primer 引物對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行PCR擴增，結(jié)果顯示，擴增的目的條帶為378 bp 左右（含載體片段200 bp），與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。重組質(zhì)粒測序結(jié)果與ΝCBΙ 公布的AE015928.1 序列比對，同源性100%。結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，由質(zhì)粒濃度計算出標準品質(zhì)?？截悢?shù)為2.2×1012copies/μL。

圖2 重組質(zhì)粒pEASY?-AE01 的酶切鑒定

2.3 熒光定量PCR 標準曲線和熔解曲線 由標準曲線可見，標準品質(zhì)粒在1.1×102～1.1×1011copies/μL 呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 9（圖3）[13]。熔解曲線測試結(jié)果為單一波峰，產(chǎn)物Tm 值均一，為79.6℃，表明該方法特異性較好（圖4）。

圖3 B.thetaiotaomicron SYBR Green 熒光定量PCR 的標準曲線

圖4 B.thetaiotaomicron 熒光定量PCR 方法的熔解曲線

2.4 特異性試驗 使用本試驗設(shè)計的B.thetaiotaomicron的AE01 引物，以B.thetaiotaomicron、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、植物乳桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、地中海擬桿菌和擬桿菌副生菌株8 種腸道細菌的基因組DΝA 為模板,進行熒光定量PCR 檢測，除B.thetaiotaomicron陽性對照在ct 值為12 左右起峰，其余均在ct 值為35 之后起峰，證明該方法特異性較好（圖5）。

圖5 B.thetaiotaomicron 熒光定量PCR 特異性試驗擴增曲線

2.5 敏感性試驗 將10 倍梯度稀釋后的標準品質(zhì)粒，取拷貝數(shù)為1.1×1011～1.1×102copies/μL 的標準品質(zhì)粒進行普通PCR 反應(yīng)，取拷貝數(shù)為1.1×1011～1.1×102copies/μL的標準品質(zhì)粒進行SYBR Green 熒光定量PCR，結(jié)果顯示普通PCR 的最低檢出量為1.1×105copies/μL（圖6），而SYBR Green 熒光定量PCR 在體系中含有110 copies 標準質(zhì)粒時依然可以產(chǎn)生特異性擴增（圖7），比普通PCR靈敏性高出1 000 倍，證明該方法具有較好的靈敏性。

圖6 重組質(zhì)粒pEASY?-AE01 普通PCR 擴增

圖7 B.thetaiotaomicron 熒光定量PCR 敏感性擴增曲線

2.6 重復(fù)性試驗 取4 個濃度的質(zhì)粒標準品對本方法進行重復(fù)性測定。以1×108、1×107、1×106、1×105copies/μL為標準品模板進行組內(nèi)重復(fù)性試驗[14]，結(jié)果顯示，不同拷貝數(shù)模板變異系數(shù)均不高于1.23%（表1），表明本方法較穩(wěn)定，重復(fù)性較好。

表1 B.thetaiotaomicron 熒光定量PCR 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.7 小鼠糞便樣品中B.thetaiotaomicron檢測 使用來自12 份小鼠糞便中的細菌DΝA 為模板，利用本研究中建立的SYBR Green 熒光定量PCR 方法進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃B.thetaiotaomicron的試驗組小鼠糞便中的B.thetaiotaomicron均多于未灌菌對照組小鼠糞便中的B.thetaiotaomicron含量（圖8），與預(yù)期結(jié)果相符。證明本研究建立的方法可以應(yīng)用于B.thetaiotaomicron的定量檢測，為B.thetaiotaomicron后續(xù)的研究提供一定的實驗室基礎(chǔ)。

圖8 小鼠糞便中B.thetaiotaomicron 擴增曲線

3 討論

B.thetaiotaomicron作為一種腸道有益菌，其在幫助宿主吸收多糖以及提高宿主營養(yǎng)利用率、維持腸道微生態(tài)平衡、調(diào)控脂肪的積累、加快腸道黏膜的血管形成和提高宿主的免疫力等方面均有非常重要的作用[15-16]。此外，B.thetaiotaomicron在營養(yǎng)物質(zhì)的代謝方面有重要作用，具有降解難被宿主消化的日糧多糖的巨大能力，是腸道中降解各種糖苷鍵的基礎(chǔ)微生物[17]。B.thetaiotaomicron不僅在營養(yǎng)代謝方面有重要作用，越來越多的證據(jù)表明其與肥胖、糖尿病、高血脂和腸道炎癥方面有一定作用，已經(jīng)成為一個研究熱點[18]。

B.thetaiotaomicron做為嚴格的厭氧菌，傳統(tǒng)的細菌平板培養(yǎng)計數(shù)方法費時費力，而且準確性不高，重復(fù)性較差，建立B.thetaiotaomicron的定量檢測方法顯得尤為重要。實時熒光定量PCR 等分子生物學方法，具有高敏感性和特異性等特點。實時熒光定量PCR 是一種在DΝA 擴增反應(yīng)中，以熒光化學物質(zhì)測定每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。實時熒光定量PCR 不僅能夠定性，還能對待測樣品中的特定DΝA 序列進行相對定量或絕對定量分析[19]。實時熒光定量PCR 耗時短，操作簡單，敏感性也顯著高于普通PCR 方法，且重復(fù)性高，因而被廣泛應(yīng)用于各種微生物的檢測。實時熒光定量PCR 檢測是新型冠狀病毒核酸快速診斷確認的首選方法和常用手段[20]。

目前，有關(guān)B.thetaiotaomicron的定量檢測方法報道較少。Lee-Jene[8]建立了該菌的普通PCR 檢測方法，可以將B.thetaiotaomicron從其他幾個親屬關(guān)系較近的擬桿菌中鑒別出來。但普通PCR 方法只能定性不能定量檢測，且耗時較長。張麗萍等[21]建立了該菌的TaqMan 熒光定量檢測方法，最低檢出量為3.37 個細菌，其敏感性要高于本研究建立的SYBR Green 熒光定量PCR 方法，但是TaqMan 探針法的成本高于SYBR Green。易金陽等[22]在B.thetaiotaomicron16S rRΝA V6區(qū)設(shè)計引物，建立了該菌的SYBR Green 實時熒光定量PCR 方法，但沒有驗證其特異型，也沒有明確其最低檢出量，方法建立不夠完善。本研究建立了一種B.thetaiotaomicron的SYBR Green 熒光定量PCR 檢測方法，經(jīng)特異性驗證顯示在常見的幾種腸道細菌中只能檢測出B.thetaiotaomicron，且最低檢測數(shù)為110 copies，比普通PCR 敏感性高1 000 倍，操作簡單，耗時短。因此，該方法的建立為B.thetaiotaomicron的快速鑒定、定量檢測和腸道菌群分析提供了一種有效手段，為其后續(xù)相關(guān)研究奠定了一定基礎(chǔ)，也為其他細菌，尤其是目前不能體外培養(yǎng)的或者較難培養(yǎng)的細菌的監(jiān)測提供了借鑒。但本研究建立的SYBR Green 熒光定量PCR 方法的敏感性不如張麗萍[21]等建立的TaqMan 探針熒光定量檢測方法，并且本研究僅使用小鼠糞便樣品進行了驗證，適用范圍不夠?qū)挿?。因此，未來還需要建立更加簡單快速、敏感的檢測方法，為B.thetaiotaomicron的研究提供一定技術(shù)支持。