Sirt2 在哺乳動物卵母細胞成熟過程的調(diào)節(jié)作用與機制研究

李 颯，房曉歡，張效生，李俊杰,3*，孫樹春,3*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河北保定 071000；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；3.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071000）

隨著動物胚胎生物技術(shù)的快速發(fā)展，對于高質(zhì)量卵母細胞的需求日益增加。卵母細胞體外成熟技術(shù)成為獲得成熟卵母細胞的重要途徑，但現(xiàn)有體外成熟培養(yǎng)體系生產(chǎn)的卵母細胞質(zhì)量和發(fā)育潛能遠低于體內(nèi)成熟的卵母細胞[1]。因此，研究卵母細胞成熟機制，優(yōu)化體外成熟培養(yǎng)體系，提高卵母細胞質(zhì)量具有重要的實際應用價值。Sirt2 是進化上保守的沉默信息調(diào)節(jié)因子（Sirtuins）家族中的一員，為依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（ΝAD+）活性的一種組蛋白去乙?；?。Sirt2 廣泛表達于哺乳動物的多種組織和器官，主要位于細胞質(zhì)[2]。近年來研究表明Sirt2 在調(diào)節(jié)卵母細胞成熟過程中發(fā)揮著重要作用[3-4]。抑制Sirt2 活性會引發(fā)小鼠卵母細胞紡錘體異常、染色體錯配，導致減數(shù)分裂阻滯[5]；促進Sirt2 表達可提高卵母細胞的抗氧化能力，減少細胞凋亡，改善衰老引起的卵母細胞缺陷，有利于卵母細胞成熟[6]。本文主要綜述了Sirt2 的生物學特性及其在哺乳動物卵母細胞成熟過程的作用與調(diào)節(jié)機制，以期為提高哺乳動物卵母細胞體外發(fā)育能力的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 Sirt2 的生物學特性

1.1 Sirt2 結(jié)構(gòu) Sirt2 由催化核心區(qū)域、Ν 末端和C 末端調(diào)節(jié)區(qū)域三部分組成。催化核心區(qū)域包括一大一小2個結(jié)構(gòu)域：大結(jié)構(gòu)域是經(jīng)典的Rossmann 折疊結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合ΝAD+，保守性相對較高；小結(jié)構(gòu)域由鋅指結(jié)構(gòu)和螺旋結(jié)構(gòu)組成，主要起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域的作用，保守性相對較低。大小結(jié)構(gòu)域由4 個環(huán)連接，構(gòu)成底物結(jié)合口袋和催化活性中心。Ν 末端和C 末端調(diào)節(jié)區(qū)域可輔助提高Sirt2 的去乙?；富钚訹7]。

1.2 Sirt2 活性的影響因素 ΝAD+是Sirt2 催化的去乙?；磻匦璧妮o酶，其濃度可直接影響Sirt2 活性[8]。此外，Sirt2 活性也可通過翻譯后修飾調(diào)節(jié)。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300 可直接乙?；疭irt2，進而抑制Sirt2 的去乙?；富钚訹9]。酪氨酸激酶c-Src 可使Sirt2 的第104 位酪氨酸磷酸化從而減弱其去乙?；富钚?，并降低Sirt2 蛋白的穩(wěn)定性[10]。除乙?；土姿峄揎椡?，泛素化修飾也可調(diào)節(jié)Sirt2 活性。Choi 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，泛素連接酶Cbl 可通過泛素化提高Sirt2 蛋白水平和穩(wěn)定性。

1.3 Sirt2 的作用底物 Sirt2 可以組蛋白為底物發(fā)揮去乙酰化作用，調(diào)控細胞內(nèi)染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達。Sirt2 在細胞周期G2/M 轉(zhuǎn)換期由細胞質(zhì)遷移至細胞核，使組蛋白H4 第16 位賴氨酸（H4K16）發(fā)生去乙?；?，從而調(diào)節(jié)細胞中期染色質(zhì)凝集[12]。Eskandarian 等[13]研究表明，在單核細胞李斯特氏菌感染的情況下，Sirt2可使H3K18 去乙?；⒄{(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。另有研究發(fā)現(xiàn)，Sirt2 可使H3K56 去乙酰化，從而影響染色體組裝與基因合成[14]。

除組蛋白外，Sirt2 也可利用非組蛋白為底物，調(diào)控機體生理代謝過程。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt2 可通過抑制糖異生的限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PEPCK1）的蛋白酶體降解，在調(diào)節(jié)碳水化合物代謝中發(fā)揮重要作用[15]。此外，檸檬酸裂解酶可被Sirt2 去乙?；龠M其泛素化和降解，進而調(diào)控脂肪酸從頭合成[16]。Sirt2 還可使FoxO3a 去乙酰化，從而激活SOD2 和過氧化氫酶誘導抗氧化反應[17]。

2 Sirt2 在哺乳動物卵母細胞成熟過程的作用

2.1 Sirt2 在卵母細胞減數(shù)分裂中的作用 精確調(diào)控紡錘體裝配和染色體分離對于卵母細胞減數(shù)分裂的正常進行至關(guān)重要。抑制卵母細胞中Sirt2 表達會損害卵母細胞紡錘體及染色體功能，影響卵母細胞成熟，正常卵母細胞紡錘體在MΙ 中期呈典型的雙極桶形結(jié)構(gòu)，敲低Sirt2后卵母細胞紡錘體出現(xiàn)異常，甚至未形成紡錘體[5,18]。在MΙΙ 中期，對照組卵母細胞染色體在赤道板上排列整齊，而敲低Sirt2 后不僅染色體發(fā)生錯位，甚至出現(xiàn)不規(guī)則的染色體團塊，導致非整倍體產(chǎn)生[5,18]。此外，抑制Sirt2 表達還會造成減數(shù)分裂阻滯，SirReal2 是一種有效的Sirt2 抑制劑。研究表明SirReal2 影響牛卵母細胞的正常細胞周期，主要表現(xiàn)為MΙΙ 期卵母細胞比例減少，GV 期、MΙ 期細胞比例增加，并且顯著降低體外受精后卵裂率，表明抑制Sirt2 表達影響卵母細胞減數(shù)分裂[18]。

2.2 Sirt2 在卵母細胞內(nèi)細胞器分布中的作用 Sirt2 參與調(diào)控細胞質(zhì)成熟過程中皮質(zhì)顆粒（CGs）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）和線粒體等細胞器的動態(tài)分布。CGs 在卵母細胞成熟過程中不斷增多，并逐漸向皮質(zhì)區(qū)遷移，其均勻分布于卵母細胞皮質(zhì)區(qū)通常被認為是細胞質(zhì)成熟的標志。使用Sirt2 的抑制劑SirReal2 處理卵母細胞后可明顯減少CGs 在皮質(zhì)區(qū)的分布[18]。ER 具有調(diào)節(jié)鈣離子動態(tài)平衡、蛋白質(zhì)折疊及參與信號轉(zhuǎn)導等生理功能，對于卵母細胞的發(fā)育有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，牛GV 期卵母細胞ER定位于皮質(zhì)區(qū)域，MΙΙ 期卵母細胞ER 聚集呈小簇，均勻分布于細胞質(zhì)內(nèi)，若ER 分布異常則會嚴重影響卵母細胞質(zhì)量[19]。SirReal2 處理牛卵母細胞后可劑量依賴性地降低ER 在細胞質(zhì)中分布的百分比，干擾ER 的正常分布，從而影響卵母細胞正常發(fā)育[18]。線粒體是卵母細胞的能量代謝中心，可為卵母細胞生長和發(fā)育提供能量來源。抑制Sirt2 表達會破壞線粒體在細胞質(zhì)中的正常分布，影響卵母細胞成熟[18]。因此，Sirt2 能夠通過調(diào)控細胞器分布影響卵母細胞的發(fā)育進程。

2.3 Sirt2 在卵母細胞老化中的作用 隨著年齡增長，雌性哺乳動物的卵母細胞質(zhì)量發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的下降。Sirt2 的表達在卵母細胞和卵丘細胞老化過程中呈下降趨勢[6,20]。研究表明Sirt2 表達量降低是導致卵母細胞年齡依賴性損傷的眾多因素之一，老化卵母細胞的活性氧（ROS）水平激增，抗氧化能力降低，而過表達Sirt2 可使老齡小鼠卵母細胞的ROS 水平降低，恢復卵母細胞的發(fā)育能力[5-6]。卵母細胞老化伴隨著細胞凋亡，抑制Sirt2表達會造成老化卵母細胞的凋亡率顯著增加。此外，細胞自噬水平也受Sirt2 表達的影響。抑制Sirt2 表達可通過上調(diào)自噬標志物LC3 ΙΙ/LC3 Ι 比值和降解自噬底物SQSTM1，增加老化卵母細胞的自噬活性，誘導卵母細胞加速降解細胞質(zhì)和細胞器[21]。眾多研究表明，卵母細胞老化損傷可通過過表達Sirt2 得以緩解[5,6,22]。此外，褪黑素[23-24]、咖啡因[25]、煙酰胺單核苷酸[6]等物質(zhì)可通過調(diào)控Sirt2 減緩卵母細胞的老化。

2.4 Sirt2 在顆粒細胞功能中的作用 卵泡顆粒細胞包括壁層顆粒細胞和卵丘細胞，其對于卵母細胞成熟和發(fā)育均具有重要作用。Sirt2 與類固醇激素的合成有關(guān)，在牛顆粒細胞培養(yǎng)過程中干擾Sirt2 表達會誘導孕酮分泌，抑制雌二醇、睪酮的分泌，PPARs/LXRα通路也受到抑制，表明Sirt2 可參與調(diào)控類固醇激素生成[26]。此外，Sirt2 參與維持卵丘細胞與卵母細胞間的縫隙連接的信息通訊（GJΙC）。卵母細胞發(fā)育所需營養(yǎng)以及調(diào)控信號都要通過卵母細胞與卵丘細胞間的GJΙC 來實現(xiàn)，缺失縫隙連接蛋白的小鼠卵母細胞不能正常減數(shù)分裂[27]。在牛卵丘卵母細胞復合體（COCs）中，Sirt2 通過下調(diào)MEK/ERK 信號通路抑制縫隙連接蛋白43（Cx43）磷酸化，從而提高Cx43 通道的通透性，促進卵母細胞和卵丘細胞之間的信息交流[28]。Sirt2 還可通過使COCs中的Cx43 去乙?；?，改變Cx43 的膜定位，從而調(diào)控GJΙC[28]。因此，Sirt2 能夠通過調(diào)控顆粒細胞的激素分泌及GJΙC，從而影響卵母細胞成熟。

3 Sirt2 調(diào)節(jié)卵母細胞成熟的機制

3.1 Sirt2 調(diào)節(jié)組蛋白和微管蛋白乙?；癄顟B(tài) 組蛋白是染色質(zhì)的主要組成成分之一，可通過發(fā)生乙?；⒓谆?、磷酸化等共價修飾參與染色質(zhì)構(gòu)象的調(diào)節(jié)。Sirt2在G2/M 過渡階段穿梭到細胞核，使H4K16 去乙酰化，從而使染色質(zhì)的構(gòu)型更為緊密[12]。敲低小鼠卵母細胞Sirt2 后，H4K16 乙?；眲≡黾?，抑制染色質(zhì)纖維的折疊，影響染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的形成，從而干擾減數(shù)分裂過程中染色體的正常分離[5]。

微管蛋白是紡錘體的主要組成部分，是最豐富的非組蛋白之一，正常紡錘體的裝配和功能需依賴微管動力學的調(diào)控，微管通過動粒與染色體著絲粒連接參與染色體分離過程。敲低小鼠卵母細胞的Sirt2 后，出現(xiàn)大量游離的著絲點，造成著絲粒-微管間的穩(wěn)定性降低[5]。BubR1是紡錘體組裝檢驗點（SAC）的主要成分。Qiu 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，Sirt2 通過去乙?；疭AC 蛋白BubR1-K243影響著絲粒-微管之間的相互作用。另有研究表明，RAB35/RAB23/KΙF17/KΙF18a 等蛋白能夠通過影響Sirt2 調(diào)控微管蛋白乙?；阶兓痆30-32]。因此，Sirt2能夠通過影響組蛋白和微管蛋白乙酰化狀態(tài)，調(diào)控染色體分離與紡錘體組裝，促進卵母細胞成熟。

3.2 Sirt2 調(diào)節(jié)氧化應激 Sirt2 可通過調(diào)控卵母細胞的抗氧化能力抵抗氧化應激，影響卵母細胞成熟。ROS是影響卵母細胞質(zhì)量和發(fā)育潛能的主要因素之一，過多的 ROS 會影響卵母細胞成熟并阻滯胚胎發(fā)育。而細胞抗氧化系統(tǒng)成分，如超氧化物歧化酶（SOD）、錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）等，可使卵母細胞避免體外成熟過程中ROS誘導的有害作用。Xu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，抑制牛卵母細胞中Sirt2 的表達可乙酰化FoxO3a，降低其下游抗氧化基因SOD2和CAT的表達，導致氧化還原穩(wěn)態(tài)的紊亂。反之，促進Sirt2 表達可引起FoxO3a 去乙酰化，提高其與DΝA 的結(jié)合活性，進而提高MnSOD 的表達[33-34]。卵母細胞發(fā)育過程中能夠產(chǎn)生大量葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD），G6PD 可通過促進ΝADPH 的生成，產(chǎn)生GSH 抵抗氧化應激[35]。過表達Sirt2 的小鼠卵母細胞中G6PD 的活性顯著升高，ROS 水平降低，提高了細胞的抗氧化能力[7]。另外，Lamas-Toranzo 等[36]研究表明，Sirt2 可通過去乙?；⒓せ頖6PD 活性提高牛卵母細胞的發(fā)育能力。

3.3 Sirt2 調(diào)節(jié)線粒體能量代謝 卵母細胞能量代謝受損是導致卵母細胞質(zhì)量降低的主要因素之一。線粒體是細胞質(zhì)中含量最為豐富的細胞器，是細胞的能量加工廠，葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，最終都會轉(zhuǎn)入線粒體的氧化呼吸鏈，合成ATP。因此，確保正常線粒體功能對于維持卵母細胞能量代謝至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt2 會影響線粒體合成，線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）能夠調(diào)控線粒體DΝA 拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性，抑制卵母細胞中Sirt2 表達則會導致TFAM 的表達下調(diào)，影響線粒體生物合成的正常運行[18]。Sirt2 還能夠調(diào)控線粒體分裂-融合動力學，抑制Sirt2 表達會使線粒體融合蛋白2（Mfn2）表達下調(diào)以及線粒體分裂蛋白1（DRP1）表達上調(diào)，使線粒體的融合與分裂失衡，從而引起自身形態(tài)和功能的紊亂[18]。此外，Sirt2 能夠調(diào)控線粒體中ATP 的合成。Xu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，牛卵母細胞體外成熟過程中，抑制Sirt2 表達會導致線粒體膜電位降低、ROS 水平升高，從而影響ATP 的生成?？傊琒irt2 能通過影響線粒體功能調(diào)控卵母細胞能量代謝。

4 結(jié)語

Sirt2 作為一種去乙?；?，能夠通過影響卵母細胞的乙?；癄顟B(tài)、抗氧化能力、能量代謝等多個方面，參與調(diào)控卵母細胞成熟，其為減緩卵母細胞衰老、提高卵母細胞及胚胎質(zhì)量提供了重要思路。因此，開發(fā)和優(yōu)化Sirt2 激活劑對于動物胚胎生產(chǎn)、人類因年齡引起的不孕癥等方面具有重要的應用前景。但Sirt2 在不同的物種中的作用效果還需進一步研究。此外，Sirt2 是否可通過影響其他上下游分子和調(diào)節(jié)通路，從而影響動物生殖能力，仍需要進一步探討。