肝細(xì)胞癌中VEGF和c-Met的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系

磨福喜，吳雪銘，龍喜帶，林潔，黃炳臣

(1. 廣西河池市人民醫(yī)院，右江民族醫(yī)學(xué)院附屬河池醫(yī)院病理科，廣西 河池 547000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西 百色 533000)

肝細(xì)胞癌(hepatoellular carcinoma，HCC)為消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，常發(fā)生于慢性肝炎、肝硬化和異常增生結(jié)節(jié)的基礎(chǔ)上，發(fā)生過程隱匿，多數(shù)患者確診時已為中晚期，手術(shù)及化療效果差，5年生存率僅10%左右[1]。在分子水平研究HCC的侵襲轉(zhuǎn)移及其與微環(huán)境和機(jī)體的相互作用，尋找預(yù)測指標(biāo)和治療靶點是當(dāng)前肝癌研究的熱點。由于抗血管生成治療在消化道多種惡性腫瘤的治療中取得顯著療效，確定和評估HCC患者抗血管治療的潛在受益者，對HCC患者的治療尤為重要。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 可誘導(dǎo)微血管形成和血液循環(huán)的建立，是癌細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。肝細(xì)胞生長因子受體(c-mesenchymal-epithelia transition factor，c-Met)是肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF) 的特異性受體，HCF與c-Met發(fā)生特異性結(jié)合，激活HGF/c-Met信號通路，使該通路上多種底物發(fā)生磷酸化，調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化[2]。我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測VEGF、c-Met在HCC中的表達(dá)，探討兩者在HCC侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2018—2020年河池市人民醫(yī)院和右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的126例HCC手術(shù)切除石蠟標(biāo)本，其中男98例，女28例，年齡28～72歲，平均51歲，≤50歲71例、>50歲55例，Edmondson分級Ⅰ、Ⅱ級87例，Ⅲ、Ⅳ級39例；腫瘤直徑≤5 cm 57例、>5 cm 69例；有微血管浸潤46例、無微血管浸潤80例；癌旁伴肝硬化106例、無肝硬化20例；HBsAg陽性64例、陰性62例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例、無轉(zhuǎn)移86例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ80例、Ⅲ+Ⅳ46例。所有病例術(shù)前均未行放化療或生物治療。

1.2 試劑和方法 所有組織標(biāo)本離體30 min內(nèi)切開，10%福爾馬林固定24～36 h，石蠟包埋。鼠抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人c-Met單克隆抗體、SP即用型免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。石蠟組織切片厚4 μm，脫蠟、水化后按照說明書免疫組化染色步驟進(jìn)行。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知陽性的肺腺癌組織作陽性對照。

1.3 結(jié)果判定 VEGF染色陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，c-Met陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，以黃色、棕黃色、棕褐色為陽性著色，染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為綜合陽性細(xì)胞比率及陽性強(qiáng)度進(jìn)行半定量評分，染色強(qiáng)度：無著色為0分、黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分、10%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、≥76%為4分。兩項得分相乘≥6分為高表達(dá)病例組，<6分為低表達(dá)病例組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 17.0軟件包處理數(shù)據(jù)。VEGF和c-Met在HCC中的表達(dá)與臨床病理特征的差異用χ2檢驗，相關(guān)分析采用列聯(lián)相關(guān)系數(shù)表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF和c-Met在HCC組織中的表達(dá) VEGF染色陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)、c-Met陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色、棕褐色。VEGF和c-Met在126例HCC中的高表達(dá)率分別為54.76%(69/126)和42.86%(54/126)。

2.2 VEGF和c-Met高表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系 VEGF高表達(dá)與HCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.493，P=0.019；χ2=16.149，P<0.001)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、微血管浸潤、肝硬化、HBsAg狀況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；c-Met在Ⅲ、Ⅳ期的高表達(dá)率為54.35%(25/46)，明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者的36.25%(29/80)(χ2=3.906，P=0.048)，與HCC患者年齡、性別、Edmondson分級、腫瘤最大直徑、微血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌旁組織伴肝硬化等臨床病理參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 VEGF和c-Met的表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 VEGF和c-Met在HCC中表達(dá)的相關(guān)性 126例HCC癌組織中VEGF和c-Met均陽性表達(dá)33例、陰性36例，VEGF陽性而c-Met陰性36例、c-Met陽性而VEGF陰性21例，VEGF和c-Met在HCC中的表達(dá)無相關(guān)性(C=0.110，P=0.21)。

3 討論

腫瘤的生長依賴腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤血管的生成。VEGF是誘導(dǎo)腫瘤血管生成的最重要分子，主要由腫瘤細(xì)胞以旁分泌方式與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的VEGFR-1、VEGFR-2結(jié)合，激活下游P44/P42-MAPK和PI3K-AKT通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤新生血管的生長[3]。研究發(fā)現(xiàn)VEGF蛋白在消化道腫瘤和乳腺癌、子宮頸癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)[4-6]，并且高表達(dá)和腫瘤的轉(zhuǎn)移和患者不良預(yù)后相關(guān)[7]。Li XY等[8]通過檢測胃癌組織中VEGF的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)陽性與患者淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。黃澄澄等[9]應(yīng)用免疫組化檢測VEGF在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)陽性率為65.7%，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期VEGF表達(dá)率逐漸增加，與患者的性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位和腫瘤分化程度無關(guān)。吳志國等[10]對98例HCC組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)VEGF陽性表達(dá)與HCC患者癌組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、包膜完整性、門脈侵犯和甲胎蛋白表達(dá)均存在明顯相關(guān)。體外實驗發(fā)現(xiàn)[11]，抗血管生成藥物阿帕替尼作用于HepG2細(xì)胞后，顯著下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2、上調(diào)促凋亡基因Bax表達(dá)，說明VEGF通過Bcl-2和Bax途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞增生和抑制凋亡的作用。VEGF與其受體VEGFR-1、VEGFR-2結(jié)合，通過誘導(dǎo)腫瘤血管形成，促進(jìn)腫瘤增殖與侵襲轉(zhuǎn)移。本文實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，126例HCC組織中VEGF的陽性率為54.76%，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期越高者，其VEGF陽性率越高。提示VEGF高表達(dá)促進(jìn)HCC的進(jìn)展和不良預(yù)后，其機(jī)制可能與腫瘤血管的大量生成，瘤細(xì)胞浸潤界面擴(kuò)大和新生毛細(xì)血管基底膜的不完整性，腫瘤細(xì)胞易于進(jìn)入血循環(huán)，VEGF的表達(dá)水平可以反映和判斷HCC的預(yù)后。

c-Met是Met基因編碼產(chǎn)生的具有自主磷酸化活性的跨膜受體，是存在于受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)介導(dǎo)的信號通路中的一種多功能跨膜酪氨酸激酶，作為HGF的受體，c-Met與HGF結(jié)合使酪氨酸激酶磷酸化，激活下游信號通路。研究表明[12]，HGF/c-Met信號與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，異常激活的 c-Met可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力。張翔等[13]對結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中免疫組化檢測c-Met表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，c-Met在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，其在癌組織中的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，陽性患者3年存活率明顯低于陰性患者。謝斌等[14]檢測HCC中c-Met的表達(dá)發(fā)現(xiàn)其陽性表達(dá)率為38.3%，其表達(dá)與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、包膜形成及癌細(xì)胞的分化程度有關(guān)，與HCC患者的性別、年齡、腫瘤最大直徑和TNM分期無關(guān)。Tang XL等[15]研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼可以體外抑制肺小細(xì)胞癌H446細(xì)胞c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低細(xì)胞活力、誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯、降低細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，說明c-Met參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并與患者的不良預(yù)后有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)，c-Met在Ⅲ、Ⅳ期HCC患者癌組織中的表達(dá)率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期的患者，提示c-Met參與HCC的惡性進(jìn)展和患者更低的生存率。作為原癌基因，c-Met與HGF結(jié)合后，促進(jìn)AKT/mTOR等多種信號通路的激活，介導(dǎo)激活下游重要分子，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，可作為預(yù)測HCC患者預(yù)后的指標(biāo)和潛在治療靶點。

相關(guān)分析顯示，HCC組織中VEGF和c-Met的表達(dá)無相關(guān)性，提示HCC的惡性進(jìn)展是多基因參與、多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常調(diào)控結(jié)果。VEGF蛋白在HCC中的高表達(dá)與腫瘤侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，c-Met的高表達(dá)可能預(yù)示更加不良的預(yù)后和低生存率。聯(lián)合檢測VEGF和c-Met的表達(dá)情況有助于臨床對HCC患者的治療選擇和預(yù)后判斷。