乙肝病毒表面抗原沖擊的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)記憶T細(xì)胞的形成及增殖研究

黃新亮，余方流，伍云云，王鳳各，董博翰

(皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

據(jù)WHO報(bào)道[1]，全球約有2.57億慢性乙型肝炎病毒感染者，目前對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)感染的免疫防御機(jī)制尤其是細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制尚未闡明，且HBV慢性感染過程中病理性免疫耐受的確切機(jī)制也未明。雖然記憶T細(xì)胞(memory T cell，Tm)比非記憶性T淋巴細(xì)胞的免疫功能更強(qiáng)大且壽命更長(zhǎng)、由效應(yīng)T細(xì)胞或初始T細(xì)胞分化而來，但Tm的形成、維持、再應(yīng)答等確切的分子機(jī)制尚不清楚。

目前已知樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是遞呈抗原功能最強(qiáng)的細(xì)胞且DC負(fù)載抗原的技術(shù)成熟；已知記憶性T淋巴細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞膜分子CD45RO和某些黏附分子。Tm依據(jù)TCR分類則種類繁多，而能夠結(jié)合乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen ，HBsAg)的特異性Tm就是其中一種。

機(jī)體抗乙型肝炎病毒感染免疫過程中特異性Tm是如何形成的？增殖活性如何？本研究基于DC負(fù)載抗原的制備技術(shù)和Tm的標(biāo)志分子，進(jìn)一步用體外用乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen ，HBsAg)沖擊的DC，與自身淋巴細(xì)胞反應(yīng)，探索體外HBsAg特異性CD45RO+CD4+Tm是否形成及增殖活性如何。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇健康志愿者，納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡均為20歲，健康體檢指標(biāo)為乙型肝炎病毒(-)且無乙型肝炎發(fā)病史。

1.2 主要試劑 HBsAg、細(xì)胞培養(yǎng)基、MTT(SIG-MA公司)，熒光素標(biāo)記抗人CD4單克隆抗體、抗人CD45RO單克隆抗體、抗人CD80、CD40及HLA-DR單克隆抗體、IL-2、TNF-α、IL-4和GM-CSF(Biolegend公司)。

1.3 方法

1.3.1 HBsAg沖擊DC DC制備參看文獻(xiàn)[2]：分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整人外周血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)為2×106/ml。加入4孔細(xì)胞培養(yǎng)板。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育2 h后吸棄培養(yǎng)上清和洗滌去除非貼壁細(xì)胞，即獲得貼壁的細(xì)胞。每孔加入含GM-CSF(800 U/ml)、IL-4(500 U/ml)的10% AB血清完全培養(yǎng)基1 ml。第4天將培養(yǎng)的DC加入純化的HBsAg進(jìn)行沖擊：分低劑量實(shí)驗(yàn)組、中劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組各6例，分別以10 ng/ml 、20 ng/ml、30 ng/ml HBsAg沖擊DC；低劑量自身對(duì)照組、中劑量自身對(duì)照組、高劑量自身對(duì)照組均不用HBsAg沖擊DC。第5天加入TNF-α(250 U/ml)；培養(yǎng)第8天收集DC細(xì)胞檢測(cè)。

1.3.2 流式細(xì)胞儀鑒定DC DC培養(yǎng)過程中，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；采用抗人CD80、CD40及HLA-DR單克隆抗體和流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面標(biāo)志分子CD80、CD40及HLA-DR。

1.3.3 負(fù)載HBsAg的DC與自身淋巴細(xì)胞混合反應(yīng) 參看文獻(xiàn)[3]：取培養(yǎng)第8天的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的DC，以1×106/ml加入到4孔板中，復(fù)蘇凍存的初始T細(xì)胞，按T細(xì)胞∶DC=20∶1的比例混合。加入500 IU/ml IL-2，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4d后以臺(tái)盼藍(lán)染色、顯微鏡觀察T細(xì)胞的形態(tài)和活性。

1.3.4 流式細(xì)胞儀鑒定CD45RO+CD4+Tm 每孔100 μl PBMC細(xì)胞懸液中加入5 μl PE標(biāo)記抗人CD45RO單克隆抗體、5 μl FITC標(biāo)記抗人CD4單克隆抗體，4℃避光染色30 min，用3% FBS-PBS洗細(xì)胞1次，懸浮于500 μl 3%FBS-PBS中，再次加3% FBS-PBS調(diào)整容量為5 ml，4℃避光保存。熒光抗體染色后。用流式細(xì)胞儀分析，獲取細(xì)胞數(shù)不少于100 000。用本科室的流式細(xì)胞儀C6檢測(cè)，檢測(cè)前用BD公司提供的質(zhì)控微球進(jìn)行設(shè)置和調(diào)節(jié)。預(yù)先設(shè)置空白管、補(bǔ)償管、樣本管。先用空白管在FSC/SSC散點(diǎn)圖上圈門(圈淋巴細(xì)胞區(qū)域設(shè)門，注意將分析細(xì)胞設(shè)在門內(nèi)，盡量減少碎片摻入，保證足夠的細(xì)胞數(shù)量)。隨后以 CD4-FITC、CD45RO-PE進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)，最后測(cè)定樣本管。

1.3.5 MTT法檢測(cè)CD45RO+CD4+Tm的增殖活性 各組經(jīng)過鑒定CD45RO+CD4+Tm后，置37℃、5% CO2溫育72 h后。參看文獻(xiàn)[3]：以常規(guī)MTT法，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔OD570值。計(jì)算刺激指數(shù)表示增殖活性(SI=實(shí)驗(yàn)孔OD570/對(duì)照孔OD570)。

2 結(jié)果

2.1 DC中表達(dá)CD80、CD40、HLA-DR的百分率比較 低劑量實(shí)驗(yàn)組、中劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組分別比其相應(yīng)自身對(duì)照組DC中表達(dá)CD80、CD40、HLA-DR的百分率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表達(dá)CD80、CD40、HLA-DR的DC百分率比較 單位：%

2.2 CD45RO+CD4+Tm百分率比較 低劑量實(shí)驗(yàn)組、中劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組分別比其相應(yīng)自身對(duì)照組的CD45RO+CD4+Tm的百分率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1A、圖1B。

注：A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD45RO+CD4+Tm實(shí)例；B：各組CD45RO+CD4+Tm百分率。H低、H中、H高分別為低劑量實(shí)驗(yàn)組、中劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組；C低、C中、C高分別為低劑量自身對(duì)照組、中劑量自身對(duì)照組、高劑量自身對(duì)照組。與低劑量自身對(duì)照組配對(duì)比較，a：P<0.05；與中劑量自身對(duì)照組配對(duì)比較，b：P<0.05；與高劑量自身對(duì)照組配對(duì)比較，c：P<0.05。圖1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CD45RO+CD4+Tm百分率

2.3 CD45RO+CD4+Tm的增殖活性比較 低劑量實(shí)驗(yàn)組、中劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組分別比其相應(yīng)自身對(duì)照組的CD45RO+CD4+Tm的增殖活性顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且中劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組分別比低劑量實(shí)驗(yàn)組CD45RO+CD4+Tm的增殖活性更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：H低、H中、H高分別為低劑量實(shí)驗(yàn)組、中劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組；C低、C中、C高分別為低劑量自身對(duì)照組、中劑量自身對(duì)照組、高劑量自身對(duì)照組。與低劑量自身對(duì)照組配對(duì)比較，a：P<0.05；與中劑量自身對(duì)照組配對(duì)比較，b：P<0.05；與高劑量自身對(duì)照組配對(duì)比較，c：P<0.05。與低劑量實(shí)驗(yàn)組比較，d：P<0.05。圖2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CD45RO+CD4+Tm的增殖活性

3 討論

體外能夠構(gòu)建CD45RO+CD4+Tm且發(fā)現(xiàn)其具有良好增殖活性，這或可為免疫診斷及免疫防治提供新措施。目前診斷上尚無評(píng)價(jià)慢性乙型肝炎患者的抗乙型肝炎病毒的細(xì)胞免疫功能標(biāo)準(zhǔn)，這給選擇適應(yīng)證、實(shí)施免疫治療帶來困難。所以也無法推測(cè)免疫反應(yīng)發(fā)生后，免疫病理所致的肝損程度以及相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。這些均是導(dǎo)致治療性乙肝疫苗“走不出實(shí)驗(yàn)室”的重要因素[4]。但本研究構(gòu)建了檢測(cè)Tm的體外簡(jiǎn)易模型，有望進(jìn)一步通過臨床研究、制定HBV感染后Tm的數(shù)量參考值范圍，據(jù)此評(píng)估患者的免疫功能(現(xiàn)代免疫學(xué)亦發(fā)現(xiàn)免疫功能的增強(qiáng)主要依靠記憶細(xì)胞，例如預(yù)防性乙肝疫苗的臨床應(yīng)用已經(jīng)發(fā)現(xiàn)免疫記憶功能可持續(xù)20年或終生)。我國(guó)一般人群慢性乙型肝炎病毒感染者約7000萬例，其中慢性乙型肝炎患者約2000～3000萬例[1]；由于缺乏有效的治療措施，慢性乙型肝炎對(duì)我國(guó)社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是危害我國(guó)人群健康的重大傳染病之一。而本研究構(gòu)建了基于DC負(fù)載HBsAg的疫苗，也為探索防治慢性肝炎的新型疫苗提供新思路。近年研究者發(fā)現(xiàn)[5-6]γδT細(xì)胞作為T淋巴細(xì)胞的一種亞型，存在有不變體T細(xì)胞受體，科學(xué)家將其命名為樹突狀表皮T細(xì)胞(dendritic epidermal tcells，DETCs)，其在皮膚動(dòng)態(tài)平衡、腫瘤免疫監(jiān)測(cè)、創(chuàng)傷修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用。尤其DETCs在皮膚創(chuàng)傷或瘢痕的修復(fù)過程中，通過產(chǎn)生胰島素樣生長(zhǎng)因子促進(jìn)表皮干細(xì)胞生長(zhǎng)等機(jī)制利于創(chuàng)面的修復(fù)[5-6]。而本研究發(fā)現(xiàn)體外能夠構(gòu)建CD45RO+CD4+Tm，因而進(jìn)一步探索創(chuàng)面修復(fù)中是否有CD45RO+CD4+Tm參與、有望在美容外科領(lǐng)域利用其功能維持時(shí)間更持久的優(yōu)點(diǎn)促進(jìn)患者傷口愈合。體外檢測(cè)Tm或?yàn)樘剿魅梭w免疫奧秘提供實(shí)例。其一，有研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體對(duì)乙型肝炎病毒的適應(yīng)性免疫應(yīng)答在清除病毒中起主要作用[7]；慢性感染時(shí)，乙型肝炎病毒特異性T細(xì)胞易凋亡，產(chǎn)生細(xì)胞因子和增殖能力均顯著降低甚至功能耗竭，可能是導(dǎo)致乙型肝炎病毒持續(xù)感染的機(jī)制之一[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)體外構(gòu)建的HBsAg特異性Tm具有增殖活性，在疾病狀態(tài)下Tm數(shù)量不足或功能低下亦可能是乙型肝炎病毒慢性感染的機(jī)制之一。其二，雖然Tm的形成、維持、再應(yīng)答等確切的分子機(jī)制尚不清楚，但隨著研究的深入，有研究者發(fā)現(xiàn)了組織定居Tm[11-12]，有研究者還發(fā)現(xiàn)了活動(dòng)期結(jié)核病患者和PPD陽性健康人Tm[13]。若深入研究機(jī)體Tm的特征，細(xì)致探討免疫記憶過程，據(jù)此開發(fā)新型疫苗以防治疾病，這將是疫苗研究與開發(fā)的目標(biāo)；且當(dāng)前判斷疫苗有效性持續(xù)的時(shí)間尚需長(zhǎng)期觀察，若通過檢測(cè)記憶細(xì)胞的特征判斷疫苗的效果或可以簡(jiǎn)化評(píng)估流程。上述設(shè)想的實(shí)現(xiàn)均需體外檢測(cè)Tm。

本研究為體外構(gòu)建方便、準(zhǔn)確和靈敏的Tm模型提供了一種依據(jù)。其一，目前很少有建立探索人體Tm免疫功能的新方法，倘若在體外直接用抗原表位肽的MHC四聚體技術(shù)分離特異性Tm，或者用免疫磁珠吸附法純化機(jī)體內(nèi)含量極少的特異性Tm，則會(huì)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且費(fèi)用昂貴。而本研究的血細(xì)胞標(biāo)本來源于人體，因而操作比較簡(jiǎn)便。其二，一些研究者利用動(dòng)物模型構(gòu)建Tm，且抗原以多糖為主、缺乏乙肝病毒表面抗原特異性的Tm，因而準(zhǔn)確性有限[13-14]。其三，本研究采用了流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tm，靈敏度較高；且發(fā)現(xiàn)中劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組分別比低劑量實(shí)驗(yàn)組CD45RO+CD4+Tm增殖活性更高，這為體外獲得豐富的Tm提供實(shí)例。

本研究實(shí)驗(yàn)組的淋巴細(xì)胞經(jīng)HBsAg誘導(dǎo)，而自身對(duì)照組的淋巴細(xì)胞未經(jīng)HBsAg誘導(dǎo)且其余條件嚴(yán)格控制和實(shí)驗(yàn)組相同，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組比相應(yīng)自身對(duì)照組的CD45RO+CD4+Tm的百分率更顯著，提示實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生了HBsAg特異性CD45RO+CD4+Tm。故體外構(gòu)建HBsAg特異性Tm是可行的。本文總結(jié)了依靠DC負(fù)載HBsAg與自身淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在體外能夠構(gòu)建HBsAg特異性CD45RO+CD4+Tm且具有良好增殖活性。但Tm依據(jù)TCR分類則種類繁多，本研究以HBsAg特異性CD45RO+CD4+Tm為例，為探索免疫記憶機(jī)制僅僅邁出了第一步。有關(guān)免疫記憶持續(xù)時(shí)間的分子機(jī)制、再次應(yīng)答能力增強(qiáng)的分子機(jī)制等尚不明了；且本研究關(guān)于Tm與性別、年齡段的關(guān)系尚未詳細(xì)探討，有待擴(kuò)大樣本深入探究。