辣木葉粗多糖的制備?單糖組成及抗氧化活性研究

聶爍 吳佳怡 程乃雪 聞?wù)? 王文策

摘要 [目的]制備辣木葉粗多糖并研究其單糖組成和抗氧化活性。[方法]以華南地區(qū)辣木葉為原料，水提醇沉法、Sevage法、過氧化氫（H2O2）法提取辣木葉粗多糖，水解衍生化分析單糖組成，并通過DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、還原力等指標(biāo)評價辣木葉粗多糖體外抗氧化活性。[結(jié)果]該試驗所制備的辣木葉粗多糖提取率為7.16%，測得純度為84.33%。辣木葉粗多糖的單糖組成有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，各占56.88%、14.44%、10.54%、9.45%和4.13%。另外，試驗表明辣木葉粗多糖具有良好的自由基清除能力，抗氧化活性較好且與濃度呈正相關(guān)。[結(jié)論]該研究為辣木葉多糖的深入研究和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 辣木葉;粗多糖;制備;單糖組成;抗氧化活性

中圖分類號 R-285? 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）12-0183-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.047

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Preparation，Monosaccharide Composition and Antioxidant Activity of Crude Polysaccharide from Moringa oleifera Leaves

NIE Shuo，WU Jia yi，CHENG Nai xue et al （School of Food Science and Pharmaceutics，Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316022）

Abstract [Objective]To prepare crude polysaccharides from Moringa oleifera leaves and to study its monosaccharide composition and antioxidant activity. [Method]Using Moringa oleifera leaves in South China as raw materials，the crude polysaccharides of Moringa oleifera leaves were extracted by water extraction and alcohol precipitation method，Sevage method，and hydrogen peroxide （H2O2） method. The anti oxidant activity of Moringa oleifera leaves polysaccharide was evaluated by indicators such as DPPH free radical scavenging ability，hydroxyl free radical scavenging ability，superoxide anion free radical scavenging ability and reducing power. [Result]The extraction rate of crude polysaccharide from Moringa oleifera leaves prepared in this experiment was 7.16%，and the measured purity was 84.33%. Moringa oleifera leaves crude polysaccharides consist of mannose，rhamnose，glucose，galactose and xylose，which account for 56.88%，14.44%，10.54%，9.45% and 4.13% respectively. In addition，the experiment showed that the crude polysaccharide of Moringa oleifera leaves had good free radical scavenging ability，good antioxidant activity and positive correlation with concentration.[Conclusion]The study provides scientific basis for further research and development of Moringa oleifera leaves.

Key words Moringa oleifera leaf;Crude polysaccharide;Preparation;Monosaccharide composition;Antioxidant activity

辣木（Moringa oleifera Lam.）又稱鼓槌樹，源自印度，因其抗旱抗凍特性廣泛種植于世界各國[1]。辣木葉、花、果實、種子、種子油、樹皮和根等各個部位成分繁多，被廣泛用于傳統(tǒng)中藥中，并作為重要營養(yǎng)素的豐富來源，有“生命之樹”的美譽[2-3]。葉子是植物最常用的營養(yǎng)器官，蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素等營養(yǎng)素在辣木葉大量存在，可被添加到食物中應(yīng)用于人類和動物營養(yǎng)[4]。辣木葉中還存在許多生物活性成分，被證明有抗氧化[5-6]、抗炎和免疫調(diào)節(jié)[7]、抗菌[8]、抗病毒[9]、抗癌[10]、降血糖[11]、降血脂[12]及肝腎保護[13-14]等功效，因此應(yīng)用于許多疾病的治療，如氧化應(yīng)激[15]、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[16]、尿路感染[17]、糖尿病[18]、高血壓[19]和肝損傷[20]等。

有報道稱每100 g辣木葉中含有碳水化合物38.2 g[21]，碳水化合物含量是大豆和蘑菇中的3～4倍[22]。而碳水化合物主要以具有多種生物活性的多糖大分子的形式存在。近年來對辣木葉中多糖的研究逐漸增加，集中在辣木葉多糖的提取工藝和理化性質(zhì)方面的研究。辣木葉多糖的抗病毒、抗氧化、降血糖等功效在國內(nèi)都已有相關(guān)報道。盡管辣木葉多糖在食品、飼料、醫(yī)藥中的應(yīng)用價值得到國內(nèi)外的認(rèn)可，但王瑞琴等[23]研究指出目前我國對辣木多糖的研究尚處于探索階段，辣木多糖的提取、結(jié)構(gòu)鑒定及構(gòu)效關(guān)系等研究仍需加強。該試驗通過水提醇沉、Sevage法脫蛋白、H2O2脫色等手段制備了辣木葉粗多糖，并研究其單糖組成和體外抗氧化活性，為辣木葉多糖的深入研究和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 辣木葉，源自華南地區(qū)。

1.2 主要儀器 HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱，金壇區(qū)白塔新寶儀器廠;MULTISKAN GO酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司;TGL20MW臺式高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司;90-2定時恒溫磁力攪拌器，上海精科實業(yè)有限公司;FD-1E冷凍干燥機，北京德天佑科技發(fā)展有限公司;N-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛麟儀器有限公司;1200高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 辣木葉粗多糖的制備。

1.3.1.1 多糖的提取。辣木葉烘干粉碎，稱取適量的干燥辣木葉粉，加入蒸餾水（料液比1∶20），80? ℃提取3次，每次1.5 h。每次浸提完成后進行過濾，收集3次濾液后混合，減壓濃縮到一定量后加入4倍體積95%乙醇，靜置過夜，離心收集沉淀。沉淀用適量無水乙醇洗滌2次，50 ℃烘干。

1.3.1.2 脫蛋白、脫色。蒸餾水溶解干燥辣木葉多糖離心收集上清液，加入1/4體積的Sevage試劑 （氯仿∶正丁醇=4∶1），磁力攪拌30 min，使其充分混勻，3 000 r/min離心10 min，棄去蛋白質(zhì)和有機層，上清液再加Sevage試劑，重復(fù)以上操作數(shù)次 （至少8次） ，至上清液無游離蛋白為止。0.1% NaOH調(diào)辣木葉粗多糖溶液pH為8～9，然后滴加H2O2，40 ℃保溫，攪拌，靜置一段時間。移入透析袋（3 000 Da）在蒸餾水中透析48 h，冷凍干燥并稱重后即為辣木葉粗多糖。

多糖提取率=多糖質(zhì)量/辣木葉粉質(zhì)量×100%（1）

1.3.1.3 總糖和蛋白含量的測定。采用苯酚硫酸法[24]測定總糖含量，采用考馬斯亮藍法[25]測定蛋白含量。

1.3.1.4 脫色率的測定。在預(yù)試驗中對1%辣木葉粗多糖溶液進行全波長（200～800 nm）掃描以判斷辣木葉粗多糖的最大吸收波長。結(jié)果顯示辣木葉粗多糖無最大吸收波長，因此選用 400、420、450、480、500 nm下測定脫色前后吸光度，并按照公式（2）計算脫色率。

脫色率=脫色前吸光度-脫色后吸光度脫色前吸光度×100%（2）

1.3.2 單糖組成分析。

1.3.2.1 水解。5 mg辣木葉粗多糖，加入1 mL 2 mol/L的三氟乙酸，105 ℃水解6 h。水解后反復(fù)加入甲醇蒸出三氟乙酸，最后將辣木葉多糖溶于水中，配制成5 mg/L的溶液待用。

1.3.2.2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制。稱取等摩爾干燥至恒重的Man、GlcN、Rha、GlcUA、GalUA、Glc、Gal、Xyl、Ara、Fuc共10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品，配制成1 mg/L的水溶液。

1.3.2.3 衍生化。分別取100 μL水解完全的單糖標(biāo)準(zhǔn)品和辣木葉粗多糖溶液、120 μL 0.5 mg/L的PMP甲醇溶液與100 μL 0.3 mg/mL的氫氧化鈉溶液充分混勻，70 ℃反應(yīng)1 h，冷卻后加100 μL 0.3 mg/mL的鹽酸中和，再加700 μL氯仿，振搖后靜置，棄去氯仿相，萃取3次后離心，取上清液過微孔濾膜上高效液相色譜分析。

1.3.2.4 色譜條件。Agilent XDB-C18色譜柱;流動相為PBS（pH=6.7）/乙腈（82∶18，V/V）;流速1 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量20 μL;檢測器為DAD（245 nm）。

1.3.3 抗氧化活性的測定。

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力。試管中依次加入1 mL無水乙醇、250 μL 0.02%的DPPH乙醇溶液、1 mL不同濃度的辣木葉粗多糖溶液，混勻后室溫避光反應(yīng)30 min，在510 nm處測定吸光度記為A0;空白組中用無水乙醇代替 0.02%的DPPH乙醇溶液，測定吸光度記為A1;對照組中用蒸餾水代替辣木葉粗多糖溶液，測得吸光度記為A2。DPPH清除率按公式（3）計算。

DPPH清除率=（A1+A2-A0）/A2×100%（3）

1.3.3.2 羥基自由基清除能力。試管中依次加入1 mL 9 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、1 mL 9 mmol/L 水楊酸的50%乙醇溶液、1 mL不同濃度的辣木葉粗多糖溶液和1 mL 0.03%過氧化氫溶液，37 ℃精確反應(yīng)1 h，冷卻至室溫后510 nm測吸光度，記為A0;空白對照組中用蒸餾水代替辣木葉粗多糖溶液，測得吸光度記為A1;樣品對照組中用50%乙醇溶液代替水楊酸的50%乙醇溶液，測得吸光度記為A2。羥基自由基清除率按公式（4）計算。

清除率=[1-（A0-A2A1）]×100%（4）

1.3.3.3 超氧陰離子自由基清除能力。取1 mL不同濃度的辣木葉粗多糖溶液，加入4 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH=8.0），充分混勻后25 ℃水浴20 min，再加入0.4 mL 2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液混勻后在25 ℃反應(yīng)3 min，最后加入10 mL 2 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，在325 nm處測定吸光度記為An;空白組中用蒸餾水代替辣木葉粗多糖溶液，測定吸光度記為A0。超氧陰離子自由基清除率按公式（5）計算。

清除率=[（A0-An）/A0]×100%（5）

1.3.3.4 還原力。取2 mL辣木葉粗多糖溶液加入2 mL PBS緩沖溶液（0.02 mol/L，pH=6.6）和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液充分混勻后，置于50 ℃反應(yīng)20 min后，在混合體系中繼續(xù)加入2 mL 10%三氯乙酸溶液。然后從混合體系中取出2 mL置于試管中，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液室溫反應(yīng)10 min后，700 nm測定吸光度。吸光度越大，還原力越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉粗多糖的制備 該試驗采用水提醇沉法提取、Sevage法脫蛋白、H2O2法脫色制備辣木葉粗多糖，辣木葉粗多糖提取率為7.16%，相比陳瑞嬌[26]所述最佳提取工藝的提取率降低了1倍。該試驗在對辣木葉多糖進行了簡單的純化（脫蛋白、脫色）后計算的提取率，Sevage試劑、H2O2都會對多糖進行不同程度的降解[27]，可能是造成辣木葉粗多糖損失的重要原因。制備的辣木葉粗多糖中多糖含量為84.33%，蛋白含量僅為1.08%，多糖含量比董竹平等[28]提取的3種辣木葉多糖都要高，說明該方法制得的辣木葉粗多糖含量較高。該試驗還進行脫色率的考量，辣木葉粗多糖無最大吸收波長，辣木葉粗多糖脫色前顯橙紅色、脫色后顯淺黃色，從溶液的互補色考慮藍紫光的紫外吸收波長范圍（400～500 nm）來測定吸光度，計算得出400、420、450、480和500 nm下的脫色率分別為46.36%、52.53%、57.68%、59.00%和50.74%。目前在國內(nèi)還未發(fā)現(xiàn)對辣木葉多糖脫色率的有關(guān)報道。

2.2 辣木葉粗多糖的單糖組成

從圖1可以看出，10個單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物以及辣木葉粗多糖水解后PMP衍生物均實現(xiàn)了分離。結(jié)果顯示，辣木葉粗多糖中半乳糖含量最高，占多糖含量的56.88%，其次是葡萄糖占14.44%、木糖占10.54%、甘露糖占9.45%，鼠李糖含量最低，占4.13%。此結(jié)果與汪芳等[29]鑒定的辣木葉多糖中單糖種類大致相同，而李巧琳[30]試驗結(jié)果表明辣木葉多糖除半乳糖、葡萄糖、甘露糖和鼠李糖外還包括葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和阿拉伯糖?？梢姡蹦救~多糖一般包含半乳糖、葡萄糖、甘露糖和鼠李糖等單糖。而辣木葉的產(chǎn)地、試驗條件和試驗操作等因素可能導(dǎo)致了辣木葉多糖的單糖組成的差異。

2.3 辣木葉粗多糖的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力。

DPPH自由基因其穩(wěn)定、有最大吸收波長，常用于評價生物試樣、提取物的抗氧化能力。該試驗測試了4個不同濃度的辣木葉粗多糖DPPH自由基清除率，如圖2所示，自由基清除率與辣木葉粗多糖濃度呈正相關(guān)，2 mg/mL辣木葉粗多糖的DPPH自由基清除率高達78.91%。相比董竹平等[28]和初雅潔等[31]的試驗結(jié)果，該辣木葉粗多糖有較高的DPPH自由基清除能力。

2.3.2 羥基自由基清除能力。

羥基自由基清除能力也是評價抗氧化能力常用方法之一。由圖3可見，辣木葉粗多糖對羥基自由基的清除隨濃度的升高而增強，當(dāng)辣木葉粗多糖濃度為1.5 mg/mL時，羥基自由基清除率為29.51%。辣木葉粗多糖濃度增加到2 mg/mL時，與1.5 mg/mL相比，羥基自由基的清除率沒有顯著改變。盡管該試驗結(jié)果顯示比董竹平等[28]所測不同品種辣木葉多糖的羥基自由基清除率要低，但效果優(yōu)于海南產(chǎn)辣木葉多糖[32]，依然具有良好的抗氧化活性。

2.3.3 超氧陰離子清除能力。

超氧陰離子自由基在生物體代謝過程中產(chǎn)生，可攻擊生物大分子，引起細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，與機體衰老和病變密切相關(guān)，清除超氧陰離子自由基具有重要意義。測定不同濃度辣木葉粗多糖的超氧陰離子清除率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），辣木葉粗多糖濃度越高，超氧陰離子自由基的清除率也隨之上升。2 mg/mL辣木葉粗多糖對超氧陰離子的清除率在28.76%，略低于梁鵬等[33]的試驗結(jié)果。

2.3.4 還原力。

還原力反映抗氧化活性，還原力越強，抗氧化活性越強。辣木葉粗多糖可以將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀與三氯化鐵反應(yīng)的產(chǎn)物在700 nm有最大吸收，吸光度越高，辣木葉粗多糖的還原性越強。從圖5可以看出，吸光度與辣木葉粗多糖的濃度成正比，濃度越高，辣木葉粗多糖還原力越高。相比初雅潔等[31]所測得的6種辣木葉多糖還原力，該辣木葉粗多糖有較高的還原性。

3 結(jié)論

該研究使用水提醇沉、Sevage試劑、H2O2等手段制備得到辣木葉粗多糖，提取率為7.16%，多糖含量為84.33%，純度較高。辣木葉粗多糖單糖組成為半乳糖（56.88%）、葡萄糖（14.44%）、木糖（10.54%）、甘露糖（9.45%）和鼠李糖（4.13%）。不同濃度辣木葉粗多糖對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除反映了其良好的還原力及抗氧化活性，抗氧化活性程度取決于辣木葉粗多糖的濃度。該試驗為辣木葉多糖深入研究和開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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