牡丹秋季開(kāi)花過(guò)程中生理生化變化及DNA甲基化差異*

袁 雪 袁 濤 劉少丹

(1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心 城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室 林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100083； 2.洛陽(yáng)國(guó)際牡丹園 洛陽(yáng) 471011)

牡丹(PaeoniaSect.Moutan)是芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)植物的統(tǒng)稱，原產(chǎn)中國(guó)，觀賞價(jià)值高。絕大多數(shù)牡丹品種每年僅春季開(kāi)花一次，單株花期約7～10天?；ㄆ诙潭惺悄档さ膱@林應(yīng)用中亟待解決的問(wèn)題之一。原產(chǎn)溫帶的木本植物有一年多次開(kāi)花現(xiàn)象，如常春二喬玉蘭(Magnoliasoulangeana‘Changchun’)(蔣政等， 2019)、紫薇(Lagerstroemiaindica)(孫曉萍等， 2016)、海棠‘雪球’(Malus‘Snowdrift’)(劉嘉儀， 2017)等。許多牡丹品種有秋發(fā)現(xiàn)象，部分品種春秋兩季都可開(kāi)花(陳新露， 2000)，培育一年多次開(kāi)花品種是解決牡丹花期短而集中的方向之一。

赤霉素(GA)能夠全部或部分代替低溫打破植物芽體休眠(Chandleretal.， 1994； Pharisetal.， 1985)。赤霉素的種類較多，其中GA3在實(shí)際生產(chǎn)中被廣泛使用，尤其是在牡丹冬季溫室催花中廣泛應(yīng)用。試驗(yàn)證明，GA3具有有效促進(jìn)芽體休眠解除，提早開(kāi)花、促進(jìn)枝葉生長(zhǎng)，提高催花成花率、增大花徑等作用(張秀新， 2004； 任小林等， 2004； 張文娟， 2005； 遲東明等， 2007)。一年多次開(kāi)花牡丹當(dāng)年分化的花芽能不經(jīng)冬季低溫自然萌動(dòng)并二次開(kāi)花； GA3處理也被證明能夠促進(jìn)牡丹秋季開(kāi)花(王榮， 2007； 全璨璨， 2009)。

真核生物中DNA甲基化(DNA methylation)對(duì)基因表達(dá)有重要的調(diào)控作用。植物DNA甲基化模式的改變可以影響植物的花期、育性、花葉形態(tài)發(fā)育等重要生命活動(dòng)。Finnegan等(1998)認(rèn)為，DNA去甲基化可促進(jìn)提早開(kāi)花，且這一作用與DNA甲基化水平的降低成正比，低溫和去甲基化促進(jìn)開(kāi)花的作用是加性的。李波等(2015)和王子成等(2009)的研究也有類似結(jié)果： 降低DNA甲基化水平可促進(jìn)植物芽體休眠的解除、提前萌發(fā)和開(kāi)花； 張濤等(2018)還發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)牡丹DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因PsDRM表達(dá)水平下降和DNA去甲基化酶基因PsROS1表達(dá)水平增加以降低DNA甲基化水平，可能是外施GA3促進(jìn)牡丹芽休眠解除的作用方式之一。

本文以洛陽(yáng)地區(qū)穩(wěn)定的一年二次開(kāi)花牡丹品種‘戶川寒’(Paeoniasuffruticosa‘Togawakan’)為研究對(duì)象，對(duì)春季正常開(kāi)花后的植株在秋季(9月中旬)進(jìn)行脫葉及赤霉素(GA3)、赤霉素抑制劑多效唑(PP333)處理，觀察處理后植株形態(tài)變化、測(cè)定花芽萌動(dòng)過(guò)程中激素及糖分含量變化、分析基因組DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)，以探究牡丹秋季開(kāi)花過(guò)程中赤霉素和DNA甲基化的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在河南洛陽(yáng)以露地栽培、無(wú)病蟲(chóng)害、開(kāi)花正常、長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的40株10年以上生‘戶川寒’為試驗(yàn)材料?！畱舸ê癁槿毡酒贩N，在洛陽(yáng)于4月、11月二次開(kāi)花，花單瓣型，深紅色，雌雄蕊正常(圖1)。

1.2 田間處理

2019年9月將同年度4月自然開(kāi)花后常規(guī)養(yǎng)護(hù)的試驗(yàn)材料進(jìn)行分組及處理，每組10株，處理及采樣時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)處理及采樣時(shí)間①Tab.1 The schedule of experimental treatment and sampling

1)對(duì)照： 無(wú)脫葉、無(wú)藥劑處理。

2)處理A： 2019年9月16日，全株脫葉(人工摘除全部葉柄及葉片)。

3)處理B： 2019年9月16日，全株脫葉； 9月19日開(kāi)始，連續(xù)3天(9月21日為止)每天用650 mg·L-1GA3(分析純，源葉生物科技有限公司，上海)水溶液浸濕的脫脂棉包裹全株所有芽處理1次。

4)處理C： 2019年9月16日，全株脫葉； 9月19日開(kāi)始，連續(xù)3天(9月21日為止)每天用500 mg·L-1PP333(分析純，北京華越洋生物科技有限公司，北京)水溶液浸濕的脫脂棉包裹全株所有芽處理1次。

1.3 試驗(yàn)期間氣溫

如圖2， 2019年洛陽(yáng)從6月初至9月中旬，除3次短時(shí)間大幅度的氣溫變化外，最高氣溫穩(wěn)定在30 ℃左右，最低氣溫20 ℃以上； 9月中旬后最高氣溫逐漸降至30 ℃以下，最低氣溫降至15 ℃左右，并保持下降趨勢(shì)，9月下旬至10月上旬最高氣溫下降至20 ℃左右，最低氣溫降至10 ℃左右； 10月中旬出現(xiàn)最高氣溫小低谷(16 ℃)，之后氣溫短暫回升后持續(xù)下降，至12月2日，最低氣溫降至0 ℃以下(https:∥weather.com/zh-CN/weather/today)。

圖2 試驗(yàn)期間日最高氣溫與最低氣溫Fig. 2 The daily maximum and minimum temperatures during the experiment

1.4 激素含量測(cè)定

2019年9月至10月，分別按表1采樣日期于9:00—11： 00，在各試驗(yàn)組隨機(jī)選取枝條上部3枚長(zhǎng)勢(shì)健壯的芽(去除芽鱗后儲(chǔ)存)或3個(gè)萌動(dòng)后新生花蕾及葉片，標(biāo)記后-80 ℃保存。酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)測(cè)定激素(GA3、GA4、ABA、IAA)含量，每樣本設(shè)定3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。具體操作參照Z(yǔ)hao等(2006)，略有改動(dòng)。

1.5 可溶性糖和淀粉含量測(cè)定

與激素含量測(cè)定樣品采集方式、時(shí)間相同，用蒽酮比色法測(cè)定糖類指標(biāo)(可溶性糖、淀粉)，方法參照李合生(2000)，略有改動(dòng)。

1.6 DNA甲基化敏感多態(tài)性分析

1)接頭和引物準(zhǔn)備 MSAP分析采用的接頭序列、預(yù)擴(kuò)增引物見(jiàn)表2，選擇性擴(kuò)增引物組合見(jiàn)表3。接頭和引物均由Thermo scientific(上海)公司合成。試驗(yàn)所用KAPA Taq HotStart擴(kuò)增試劑購(gòu)自TaKaRa(大連)公司, T4 DNA連接酶購(gòu)自New England Biolabs(北京)公司、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific(上海)公司。

表2 MSAP接頭序列和預(yù)擴(kuò)增引物序列Tab.2 MSAP adapters sequences and pre-amplification primer sequences

表3 MSAP選擇性擴(kuò)增引物序列Tab.3 MSAP selective amplification primer sequences

2)酶切連接 取2 μL 10× T4 Buffer，1 μL E接頭，1 μL M接頭，0.41 μLEcoRⅠ，0.3 μLMseⅠ，0.3 μL T4 DNA連接酶，4樣品DNA，加ddH2O補(bǔ)齊至15 μL，在37 ℃下酶切12 h，產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)預(yù)擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系20 μL，包括2 μL 10×BufferⅠ，0.8 μLEcoRⅠ預(yù)擴(kuò)增引物(10 mmol·L-1)，0.8 μLHpaⅡ/MspⅠ預(yù)擴(kuò)增引物(10 mmol·L-1)，1.8 μL dNTP(10 mmol·L-1)，0.2 μL Hs Taq酶(5 U·μL-1)，2 μL酶切連接產(chǎn)物，12.4 μL ddH2O； PCR反應(yīng)程序設(shè)定為95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 5 min； 產(chǎn)物15 ℃保存。

4)選擇性擴(kuò)增 反應(yīng)體系20 μL，包括2 μL 10×Buffer I，0.8 μLEcoRⅠ選擇性擴(kuò)增引物(10 mmol·L-1)，0.8 μLHpaⅡ/MspⅠ選擇性擴(kuò)增引物(10 mmol·L-1)，1.8 μL dNTP(10 mmol·L-1)，0.2 μL Hs Taq酶(5 U·μL-1)，2 μL酶預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，12.4 μL ddH2O； PCR反應(yīng)程序設(shè)定為95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 5 min； 產(chǎn)物15 ℃保存。

5)3730XL測(cè)序儀(ABI公司，美國(guó))檢測(cè) 96孔板中每孔加入ROX-1200分子量?jī)?nèi)標(biāo)(北京閱微基因技術(shù)有限公司，北京)和甲酰胺混合液(體積比0.5∶8.5)9 μL，PCR產(chǎn)物1.0 μL。95 ℃變性3 min，上機(jī)檢測(cè)。

6)將檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到Genemapper4.0中分析。導(dǎo)出結(jié)果后Excel制表。

分別用EcoRⅠ/HpaⅡ、EcoRⅠ/MspⅠ組合對(duì)樣品基因組DNA酶切后，得到的樣品DNA甲基化狀態(tài)可分為4種模式：

模式Ⅰ(無(wú)甲基化： DNA雙鏈上的CCGG位點(diǎn)未發(fā)生甲基化)，EcoRⅠ+HpaⅡ 和EcoRⅠ+MspⅠ酶切都有帶，記為1，1(1表示有帶，0表示無(wú)帶)；

模式Ⅱ(半甲基化： DNA雙鏈中僅一條單鏈上CCGG位點(diǎn)甲基化)，EcoRⅠ+HpaⅡ酶切有帶，而EcoRⅠ+MspⅠ酶切無(wú)帶，記為1，0；

模式Ⅲ(全甲基化： DNA雙鏈上的CCGG序列中內(nèi)側(cè)CG位點(diǎn)處于全甲基化狀態(tài))，EcoRⅠ+HpaⅡ酶切無(wú)帶，而EcoRⅠ+MspⅠ酶切有帶，記為0，1；

模式Ⅳ(全甲基化： DNA雙鏈上CCGG位點(diǎn)外部胞嘧啶甲基化或DNA雙鏈內(nèi)外胞嘧啶都甲基化)，EcoRⅠ+HpaⅡ 和EcoRⅠ+MspⅠ酶切都無(wú)帶，記為0，0。

模式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ DNA 甲基化狀態(tài)根據(jù)單個(gè)DNA樣品電泳結(jié)果即可檢測(cè)，而檢測(cè)模式Ⅳ甲基化狀態(tài)則需比較2個(gè)或多個(gè)DNA 樣品甲基化差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽萌動(dòng)率及形態(tài)變化

牡丹‘戶川寒’能夠穩(wěn)定于一年春秋二次正常開(kāi)花，但秋季芽萌動(dòng)極不整齊且花期晚(11月上旬)，同株上不同萌動(dòng)和發(fā)育期的芽并存(圖3)，萌動(dòng)晚的花芽形成花蕾后若遭遇低溫，即使花器官已分化完全也不能開(kāi)放。

圖3 同一時(shí)間同株牡丹‘戶川寒’花芽的不同發(fā)育狀態(tài)Fig. 3 Different developmental states of P. suffruticosa ‘Togawakan’ flower buds on the same plants at the same time對(duì)照組同株花芽發(fā)育不整齊。0-3號(hào)為休眠芽， 2020年春季開(kāi)花； 4-9號(hào)花芽已萌動(dòng)， 2019年11月陸續(xù)開(kāi)花。2019年11月5日攝于洛陽(yáng)國(guó)際牡丹園。In the control group, flower buds in different developmental states appeared in one plant. No. 0-3 were dormant buds, which flowered in spring in 2020. The buds of No. 4-9 have begun to burst and flower successively in November 2019. All figures were taken on Nov. 5, 2019 in the Luoyang International Peony Garden.

牡丹‘戶川寒’4個(gè)試驗(yàn)組都有芽萌動(dòng)、開(kāi)花(圖4)，花型正常，胚珠、花藥外觀正常。對(duì)照組萌動(dòng)慢，10月18日自然萌動(dòng)(自然落葉后)，11月27日陸續(xù)進(jìn)入花期。處理B萌動(dòng)最快且開(kāi)花最早，11天(9月27日)萌動(dòng)率達(dá)81.4%，17天(10月3日)已100%萌動(dòng)，并于42天(10月28日)進(jìn)入初花期。處理A開(kāi)花時(shí)間及最終萌動(dòng)率與處理C相似，但在早期萌動(dòng)更快(圖4、圖5)。

圖4 不同處理芽的萌動(dòng)率Fig. 4 Sprouting rate of different treatments誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，同一時(shí)期不同字母表示在P<0.05水平差異顯著(單因素ANOVA檢驗(yàn))。下同。Error bars indicate SD(n=3), and the different letters for each day indicate significant differences at P<0.05(one-way ANOVA with post-hoc Duncan’s test). The same below.

圖5 不同處理對(duì)芽萌動(dòng)的影響Fig. 5 The effect of different treatments on sprouting圖中葉柄示意留存葉片，9月16日對(duì)處理A、B、C全株脫葉(當(dāng)日照片攝于脫葉前)。9月16日后僅對(duì)照尚留葉片，10月10日后植株自然落葉，不再有葉片。處理B 9月27日開(kāi)始萌動(dòng)，處理A 10月3日開(kāi)始萌動(dòng)，處理C 10月10日開(kāi)始萌動(dòng)，對(duì)照11月7日才開(kāi)始萌動(dòng)。各組萌動(dòng)后逐漸成花。The petiole in the figure shows the retained leaves. On September 16, treatment A, B and C were defoliated for the whole plant (the photos were taken before defoliation on the same day). Therefore, after September 16, leaves were left only in the control; after October 10, the plant naturally defoliated, no more leaves were left. Treatment B burst from September 27, treatment A burst from October 3, treatment C burst from October 10, and the control did not burst until November 7. Flowers gradually developed after bursting in each group.

2.2 芽(或花)的發(fā)育情況

與芽萌動(dòng)相呼應(yīng)，處理B萌動(dòng)最快且萌動(dòng)率最高，芽(芽萌動(dòng)后為花蕾)直徑和長(zhǎng)度最早出現(xiàn)大幅度增加，17天(10月3日)起直徑和長(zhǎng)度都明顯大于其他組，到42天(10月28日)初花期時(shí)，花蕾平均直徑為(1.9±0.1)cm，花枝平均長(zhǎng)度為(22.7±1.8)cm。處理A萌動(dòng)早于處理C，芽(花蕾)直徑方面，處理C在21天(10月10日)后顯著大于處理A(圖6A)； 而芽(花蕾)長(zhǎng)度方面，處理A與處理C差異始終不顯著(圖6B)。

圖6 不同處理對(duì)芽(花蕾)發(fā)育的影響Fig. 6 The effect of different treatments on the bud growth

2.3 芽體內(nèi)激素含量變化

如圖7所示，牡丹‘戶川寒’4個(gè)試驗(yàn)組GA3、GA4含量變化趨勢(shì)相似。脫葉(9月16日)使得芽體內(nèi)GA3、GA4含量在短時(shí)間內(nèi)降低，但在11天(9月27日)驟升并于17天(10月3日)時(shí)達(dá)到最大值后迅速降低(處理A)。外施GA3(9月21日處理結(jié)束)使芽體內(nèi)由于脫葉造成的低水平GA3、GA4含量逐漸升高，至24天(10月3日)時(shí)達(dá)到最大值(處理B)。說(shuō)明脫葉后的短時(shí)間內(nèi)，芽體內(nèi)GA3、GA4含量降低，但之后迅速增加，脫葉后施加GA3能加大芽體內(nèi)GA3、GA4增長(zhǎng)強(qiáng)度并延長(zhǎng)增長(zhǎng)時(shí)間。施加PP333也使脫葉造成的低水平GA3、GA4含量升高，但升幅遠(yuǎn)小于施加GA3的處理； 在處理一段時(shí)間后2種激素含量都有不同程度降低(低于僅脫葉的處理A)。說(shuō)明脫葉后施加PP333能在短時(shí)間內(nèi)使芽體內(nèi)GA3、GA4含量增加，但隨后可能會(huì)抑制GA合成。

圖7 不同處理對(duì)芽體內(nèi)激素水平的影響Fig. 7 The effect of different treatments on the phytohormone contents in buds

脫葉(處理A)使牡丹‘戶川寒’ABA含量相較對(duì)照明顯下降，但在后期(10月18日起)含量上升超過(guò)對(duì)照。外施GA3在短時(shí)間內(nèi)使芽體內(nèi)ABA含量降低更劇烈，并維持低水平狀態(tài)直至24天(10月10日)。施加PP333會(huì)使ABA含量出現(xiàn)驟升后下降。

對(duì)照組在3天(9月19日)時(shí)，IAA含量升高，6天(9月22日)時(shí)含量降低且一直維持低水平； 處理A使IAA含量下降，除3天時(shí)有大幅上升外，始終保持在較低水平直至42天(10月28日)； 施加GA3(處理B)延緩了IAA含量的持續(xù)降低，但后期IAA含量仍上升； 施加PP333(處理C)使IAA含量增加并始終高于對(duì)照和處理A。

2.4 芽體內(nèi)淀粉和可溶性糖含量變化

由圖8可知，對(duì)照組試驗(yàn)過(guò)程中可溶性糖含量增加而淀粉含量減少。3個(gè)處理組可溶性糖含量變化趨勢(shì)在試驗(yàn)前期大致相同，都在11天(9月27日)達(dá)到含量的小高峰，而后迅速降低，在17天(10月3日)達(dá)到小低谷，其后處理A、處理B含量先上升后下降，而處理C則一直保持下降趨勢(shì)。在試驗(yàn)前期3個(gè)處理組淀粉含量變化趨勢(shì)大致相同，11天之前各組含量都相對(duì)穩(wěn)定，僅有小幅升高或降低，17天時(shí)大幅降低分別達(dá)到各組最小值，之后處理A、C淀粉含量先上升后下降，而處理B含量上升后基本保持穩(wěn)定； 到42天(10月28日)，3個(gè)處理組淀粉含量相對(duì)1天(9月17日)時(shí)都有不同程度降低。

圖8 不同處理對(duì)芽體內(nèi)可溶性糖和淀粉含量的影響Fig. 8 The effect of different treatments on the contents of soluble sugar and starch in buds

2.5 DNA甲基化敏感多態(tài)性分析

2.5.1 GA3對(duì)開(kāi)花過(guò)程中甲基化水平的影響 試驗(yàn)共選用3個(gè)EcoRⅠ和6個(gè)HpaⅡ/MspⅠ 選擇性擴(kuò)增引物構(gòu)成的10個(gè)引物組合(表3)，對(duì)牡丹‘戶川寒’秋季試驗(yàn)樣品利用MSAP檢測(cè)分析其DNA甲基化狀態(tài)。

結(jié)果如表4所示。不同時(shí)期不同處理均檢測(cè)到2 330個(gè)CCGG位點(diǎn)，平均每個(gè)引物組合檢測(cè)到的甲基化位點(diǎn)數(shù)為233個(gè)?？傮w來(lái)看，脫葉后(1天)處理組DNA半甲基化水平相較對(duì)照明顯升高，之后逐漸降低； 而處理組與對(duì)照組完全甲基化水平呈現(xiàn)與其半甲基化水平相反的變化趨勢(shì)，使得處理組總甲基化水平與對(duì)照組相差較小。施加GA3(6天)后，處理B相對(duì)處理A半甲基化水平降低，但仍高于對(duì)照，而完全甲基化水平升高，但低于對(duì)照； 施加PP333(6天)后，處理C與處理A半甲基化、完全甲基化水平都基本保持同步變化，二者差異較?。?4組總體甲基化水平相近。處理B萌動(dòng)率達(dá)50%以上時(shí)(11天)，其半甲基化率達(dá)到最小值(9.4%)，但仍高于對(duì)照且低于其他2個(gè)處理組； 其完全甲基化率和總甲基化率均達(dá)到最大值(61.8%、71.2%)，且高于其他3組。處理C萌動(dòng)率達(dá)50%以上時(shí)(32天)，其半甲基化率(11.5%)低于其他3組而完全甲基化率(46.9%)和總甲基化率(66.7%)均高于其他3組。

2.5.2 GA3對(duì)秋季開(kāi)花過(guò)程中甲基化模式的影響 10對(duì)引物在各處理不同時(shí)期的樣本中共擴(kuò)增產(chǎn)生4種模式，進(jìn)一步可分為16個(gè)亞類。表5至表8分別為對(duì)照不同時(shí)期及處理A、處理B、處理C相對(duì)對(duì)照1天時(shí)各時(shí)期的甲基化模式變化統(tǒng)計(jì)。表中模式A為甲基化狀態(tài)未發(fā)生變化的位點(diǎn)，包括4個(gè)亞類； 模式B為與對(duì)照1天相比甲基化水平下降的位點(diǎn)，即這些位點(diǎn)發(fā)生了去甲基化(demethylation)，包括5個(gè)亞類； 模式C為與對(duì)照1天相比甲基化水平上升的位點(diǎn)，即這些位點(diǎn)發(fā)生了超甲基化(hypermethylation)，包括5個(gè)亞類； 模式D是與對(duì)照1天相比甲基化水平變化無(wú)法確定的位點(diǎn)，即不定型，包括2個(gè)亞類。

對(duì)比表5與表6、表7、表8，對(duì)照組各時(shí)期模式A位點(diǎn)比例較高(61.8%～70.4%)，而處理組模式A位點(diǎn)比例僅3天時(shí)為63.3%，其余各時(shí)期不足60%； 另一方面，對(duì)照組和處理組甲基化狀態(tài)為不定型(即模式D)的位點(diǎn)比例較低(對(duì)照僅1.2%～1.5%，處理組為1.5%～2.4%)； 說(shuō)明處理組甲基化比對(duì)照組甲基化變化更活躍，集中在去甲基化(模式B)和超甲基化(模式C)。

試驗(yàn)開(kāi)始后，牡丹‘戶川寒’對(duì)照DNA去甲基化位點(diǎn)數(shù)逐漸升高，3、6、11、17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)分別為275、342、317、348、335、373、410，分別占總位點(diǎn)數(shù)的11.8%、14.7%、13.6%、14.9%、14.4%、16.0%、17.6%； 發(fā)生超甲基化的位點(diǎn)數(shù)先升高，17天以后降低，17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)分別為508、473、439和435，分別占總位點(diǎn)數(shù)的21.8%、20.3%、18.8%和18.7%(表5)。

處理A在0天脫葉，1天后去甲基化位點(diǎn)數(shù)開(kāi)始增加，1、3、6、11、17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)分別為527、454、440、471、468、489、451和626，分別占總位點(diǎn)數(shù)的22.6%、19.5%、18.9%、20.2%、20.1%、21.0%、19.4%和26.9%，均高于對(duì)照相應(yīng)時(shí)期去甲基化的位點(diǎn)數(shù)； 發(fā)生超甲基化的位點(diǎn)數(shù)先升高，17天以后降低，17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)分別為608、541、538和468，分別占總位點(diǎn)數(shù)的26.1%、23.2%、23.1%和20.1%(表6)。

處理B 0天脫葉，5天外施GA3處理，處理后去甲基化位點(diǎn)數(shù)總體曲折上升，6、11、17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)分別為485、439、467、433、485和501，分別占總位點(diǎn)數(shù)的20.8%、18.8%、20.0%、18.6%、20.8%和21.5%，均高于對(duì)照相應(yīng)時(shí)期發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)(表7)。

處理C在0天脫葉，5天外施PP333處理，處理后去甲基化位點(diǎn)數(shù)除11天時(shí)驟升至605外，其余時(shí)期總體保持緩慢增加趨勢(shì)，6、11、17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)分別為481、605、445、476、534和428，分別占總位點(diǎn)數(shù)的20.6%、26.0%、19.1%、20.4%、22.9%和18.4%，均高于對(duì)照相應(yīng)時(shí)期發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)(表8)。

3 討論

研究表明，牡丹二次開(kāi)花與GA關(guān)系密切。周華(2015)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，認(rèn)為GA途徑與光周期途徑、春化途徑共同參與誘導(dǎo)牡丹‘海黃’秋季二次開(kāi)花。PP333是園藝作物常用的GA合成抑制劑，有控制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)(潘瑞熾， 2012)、影響植物的光合作用、呼吸作用、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)代謝、碳水化合物的代謝與分配、延緩植物衰老等生理效應(yīng)(宋海鳳等， 2015； 呂雙慶等， 2005)。

3.1 脫葉、激素與秋季開(kāi)花

GA3能有效解除牡丹芽體休眠，提早開(kāi)花、促進(jìn)枝葉生長(zhǎng)，提高成花率和切花品質(zhì)、增大花徑、促進(jìn)牡丹二次開(kāi)花等(任小林等， 2004； 張秀新， 2004； 張文娟， 2005； 遲東明等， 2007)； GA4能促進(jìn)植物芽體休眠解除(Rinneetal.， 2011； 溫璐華等， 2015)，ABA能抑制開(kāi)花，較高濃度的IAA能夠促進(jìn)開(kāi)花，內(nèi)源激素對(duì)芽體休眠的影響是以激素平衡為標(biāo)準(zhǔn)的(陳新露， 2000； 張秀新， 2004)。因此，本研究對(duì)不同處理GA3、GA4、ABA及IAA含量進(jìn)行了測(cè)定與分析。

牡丹‘戶川寒’能夠穩(wěn)定于一年春秋二次正常開(kāi)花，但秋季芽萌動(dòng)極不整齊且花期晚(11月上旬)，同株上不同萌動(dòng)和發(fā)育期的芽并存(圖3)，萌動(dòng)晚的花芽形成花蕾后若遭遇低溫，即使花器官已分化完全也不能開(kāi)放； 本試驗(yàn)不僅促進(jìn)了花芽萌動(dòng)且提高了萌動(dòng)整齊度(圖4)。僅脫葉、脫葉后施GA3、脫葉后施PP333都促進(jìn)了‘戶川寒’秋季較快較整齊地萌芽和生長(zhǎng)，各處理組開(kāi)花進(jìn)程依次為： 脫葉后施加GA3組>脫葉組>脫葉后施加PP333組。說(shuō)明秋季脫葉促進(jìn)了芽萌動(dòng)和生長(zhǎng)，施加GA3則疊加促進(jìn)效應(yīng)，PP333會(huì)部分抵消脫葉的促進(jìn)效應(yīng)。脫葉發(fā)揮了短時(shí)間對(duì)GA3、GA4含量的抑制作用后，芽?jī)?nèi)GA3、GA4的含量升高而ABA含量下降，施加GA3后加強(qiáng)了GA3、GA4含量升高和ABA含量下降的強(qiáng)度，且延長(zhǎng)了GA3、GA4含量上升期，而施加PP333表現(xiàn)出相反的作用； 此外，試驗(yàn)后期對(duì)照組開(kāi)花時(shí)GA3、GA4含量升高而ABA下降。Xue等(2018)認(rèn)為外施GA3能使植株通過(guò)外源吸收和自身內(nèi)源合成的方式積累GA3，從而抑制ABA功能，使牡丹品種‘紫羅蘭’二次開(kāi)花。本試驗(yàn)結(jié)果也支持這一論斷。

3.2 可溶性糖、淀粉與秋季開(kāi)花

可溶性糖與淀粉都屬于非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(non-structural carbohydrate, NSC)，是植物生長(zhǎng)過(guò)程中重要的能量供應(yīng)物質(zhì)和植物參與碳吸收與消耗的重要指標(biāo)(Lietal.， 2002； Raessleretal.， 2010)。一方面，外施赤霉素和脫葉使NSC重新分配誘導(dǎo)牡丹開(kāi)花(Xueetal.， 2019)，另一方面，多效唑在牡丹及其他植物中也被證明能夠使NSC含量增加(黃睿， 2007； 張華等， 2018)。在一些植物中，淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖被認(rèn)為是開(kāi)花的影響因素之一(鄭國(guó)生等， 2009； 高志民， 2007； 曲波等， 2010)。在本試驗(yàn)中，芽萌動(dòng)前各試驗(yàn)組可溶性糖含量明顯上升，而萌動(dòng)后一段時(shí)間內(nèi)淀粉和可溶性糖大量消耗，說(shuō)明芽萌動(dòng)前需高濃度可溶性糖以滿足萌芽時(shí)的消耗。

3.3 DNA甲基化與秋季開(kāi)花

DNA甲基化水平的改變?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著調(diào)控重要功能基因表達(dá)、基因組防御以及細(xì)胞發(fā)育與分化等方面的重要作用。一般認(rèn)為，過(guò)度甲基化會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體與DNA結(jié)合從而抑制基因的表達(dá)，而去甲基化則有利于基因表達(dá)(Richards， 1997； Lukensetal.， 2007)。因此，研究不同處理下牡丹秋季萌動(dòng)開(kāi)花過(guò)程中DNA甲基化的狀態(tài)變化，有助于從基因?qū)用娼沂灸档で锛久葎?dòng)開(kāi)花與不同處理間的聯(lián)系。本研究中，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)牡丹‘戶川寒’都還處于生長(zhǎng)期(未落葉)，處理組于9月16日(0 d)時(shí)進(jìn)行人工脫葉，對(duì)照組10月中旬自然落葉，之后自然萌動(dòng)(圖5)，即幾乎不經(jīng)歷休眠期，‘戶川寒’在落葉后新芽萌動(dòng)生長(zhǎng)。MSAP檢測(cè)結(jié)果顯示，在整個(gè)試驗(yàn)期間‘戶川寒’DNA總甲基化的變化范圍為57.3%～72.4%，開(kāi)始萌動(dòng)前達(dá)到DNA甲基化的最高水平，之后逐漸下降。這與蓋樹(shù)鵬等(2012)研究低溫解除牡丹品種‘魯荷紅’(P.suffruticosa‘Luhehong’)休眠過(guò)程中的發(fā)現(xiàn)相似： 在低溫18天時(shí)(內(nèi)休眠解除)DNA甲基化水平升至最高，之后下降。說(shuō)明內(nèi)休眠解除時(shí)植株體內(nèi)的分子調(diào)控發(fā)生了重大變化，推測(cè)DNA甲基化可能是參與調(diào)控牡丹芽體萌動(dòng)的關(guān)鍵因素。

前人研究認(rèn)為低溫促進(jìn)植物成花可能是通過(guò)調(diào)控DNA去甲基化實(shí)現(xiàn)的(Or， 2009； Lízaletal.， 2001； 蓋樹(shù)鵬等， 2012)； 藍(lán)莓(Vacciniumcorymbosum)芽休眠解除和萌發(fā)可能也與基因組去甲基化使得基因組甲基化水平降低有關(guān)(李波等， 2015)。由于本試驗(yàn)涉及處理和時(shí)期較多，故僅以對(duì)照1天時(shí)的甲基化狀態(tài)為基準(zhǔn)，比較牡丹‘戶川寒’各處理不同時(shí)期甲基化狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組甲基化狀態(tài)變化更活躍，集中在去甲基化(模式B)和超甲基化(模式C)。各處理組去甲基化率隨時(shí)間推移增加，且都高于對(duì)照組同一時(shí)期的去甲基化率。處理組芽萌動(dòng)和發(fā)育快，萌動(dòng)率和開(kāi)花整齊度高，說(shuō)明牡丹‘戶川寒’萌動(dòng)開(kāi)花可能受DNA去甲基化調(diào)控。

4 結(jié)論

牡丹‘戶川寒’能夠在秋季自然萌動(dòng)開(kāi)花，脫葉能促進(jìn)內(nèi)源GA3合成，結(jié)合外施GA3的疊加效應(yīng)，體內(nèi)GA3增加并抑制ABA，促進(jìn)其秋季提前萌動(dòng)二次開(kāi)花，且花期整齊，外施PP333一定程度抵消了脫葉引起的內(nèi)源GA3的合成促進(jìn)作用。芽從萌動(dòng)到開(kāi)花伴隨著大量糖類物質(zhì)消耗，高濃度的可溶性糖含量可能有利于芽的萌動(dòng)。牡丹‘戶川寒’可自我調(diào)控相關(guān)DNA序列 CG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，從而誘導(dǎo)其花芽在秋季萌動(dòng)，施加處理可能會(huì)提前觸發(fā)這一調(diào)控過(guò)程，其中DNA去甲基化率高更可能促進(jìn)秋季萌動(dòng)、開(kāi)花。