辣木查爾酮合成酶（CHS）基因的克隆及其序列分析

林 玲，方健超，陳觀(guān)水，艾育芳 *

（1. 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350101；2. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】辣木（Moringa oleiferaLam.）也稱(chēng)鼓槌樹(shù)，屬于十字花目辣木科辣木屬，為多年生熱帶落葉喬木，廣泛種植于亞洲、非洲和中美洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)云南、廣西、廣東、臺(tái)灣、福建等地均有種植[1?4]。辣木富含黃酮類(lèi)化合物（flavonoids）、植物蛋白、維生素A、維生素C、葉酸、泛酸、鈣、鐵、鋅、硒、鉀等多種營(yíng)養(yǎng)素，具有“超級(jí)營(yíng)養(yǎng)庫(kù)”之稱(chēng)[2]。研究表明，類(lèi)黃酮化合物是辣木葉中的主要組分之一，平均含量在3%～6%[1,4]。藥理學(xué)研究表明，辣葉黃酮類(lèi)提取物在II型糖尿病的預(yù)防和治療中可降低葡萄糖耐受、血糖及血脂含量[1]；王玲玲等[3]研究表明辣木葉總黃酮提取物能提高運(yùn)動(dòng)耐力，延緩疲勞發(fā)生。2012年我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)將辣木葉作為新資源食品，可用于功能食品開(kāi)發(fā)[3]。因此，開(kāi)展辣木植物中黃酮類(lèi)化合物的生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的克隆、功能鑒定及其調(diào)控機(jī)制的研究，有助于提高辣木的品質(zhì)及其資源的開(kāi)發(fā)利用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)黃酮類(lèi)化合物的生物合成途徑的步驟已基本清楚[5,6]。查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS，EC2.3.1.74）為III 型聚酮體合成酶（polyketide synthase，PKS）家族的一員，是啟動(dòng)黃酮類(lèi)化合物次生代謝生物合成的第1個(gè)關(guān)鍵限速酶，負(fù)責(zé)催化3分子丙二酰-CoA和1分子對(duì)香豆酰-CoA縮合形成查爾酮[7?13]，隨后進(jìn)一步產(chǎn)生各類(lèi)的黃酮類(lèi)化合物（如蘆丁，花青素等）。CHS廣泛存在于植物中，目前，已從煙草[8]、大豆[9]、藤茶[5]等眾多植物中克隆和鑒定了CHS基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，雖然對(duì)辣木基因組序列進(jìn)行了測(cè)序，但對(duì)于辣木查爾酮合成酶的克隆及注釋有待進(jìn)一步深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中辣木基因組信息結(jié)合其他植物的查爾酮合成酶基因核苷酸序列設(shè)計(jì)PCR引物，通過(guò)PCR技術(shù)分別分離1條辣木CHS基因（命名為MoCHS1）的完整開(kāi)放讀碼框序列（open reading frame, ORF）和基因組DNA（genomic DNA），并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步解析辣木類(lèi)黃酮物質(zhì)的生物合成與調(diào)控機(jī)制及CHS基因家族進(jìn)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣木葉片采取福建農(nóng)林大學(xué)田間植物園。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

采用Omega公司Plant RNA Kit提取辣木葉片總RNA，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，經(jīng)瓊脂糖電泳及核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)符合反轉(zhuǎn)錄要求的RNA 樣品溶液，置于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用湖南艾科瑞生物工程有限公司Evo M-MLV RT試劑盒進(jìn)行辣木cDNA第 一鏈的合成。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中辣木基因組信息結(jié)合其他植物CHS基因信息，利用 DNAMAN 9.0 軟件在起始密碼子及終止密碼附近設(shè)計(jì)引物一對(duì)，引物由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成，引物序列：MoCHSF:5′-GTCATCAATGGCGGCATCAGTG-3′；MoCHSR:5′-A CCACTCACTCCCTACCCTTGAT-3′。

1.4 辣木CHS1基因的克隆

利用1.3設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行辣木CHS基因的克隆。PCR反應(yīng)體系如下：MoCHSF和MoCHSR（約100 ng·μL?1）各1 μL，10×Buffer 2 μL，TaqDNA polymerase（5 U·μL?1）0.2 μL，dNTPs（10 mmol·L?1）0.5 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 14.3 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min 后，分別于94 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s和72 ℃延伸90 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物保存于4 ℃?zhèn)溆?。PCR 產(chǎn)物在經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像儀拍照，并切下目的條帶。利用OMEGA公司的Gel Extraction Kit回收純化目的DNA 片段，純化后的DNA 連接到pESAY-T1 克隆載體（TransGen Biotech），轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α菌株，篩選并經(jīng)PCR鑒定 的陽(yáng)性菌落送福州尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 辣木CHS1生物信息學(xué)分析

利用Blast軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）進(jìn)行在線(xiàn)核苷酸和氨基酸序列分析；利用Protparam（http://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行在線(xiàn)氨基酸序列相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用PSORTPrediction（https://wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位分析；利用SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行氨基酸信號(hào)肽預(yù)測(cè)；采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl/page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN 9.0進(jìn)行查爾酮合成酶基因編碼氨基酸序列多重比對(duì)分析；采用MEGA 10.0軟件構(gòu)建CHS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MoCHS1基因的克隆與結(jié)構(gòu)分析

分別以辣木的cDNA和基因組DNA為模板，利用特異引物CHSF 和CHSR 擴(kuò)增，分別獲得約1 200 bp和1 500 bp的特異條帶（圖1-A），經(jīng)過(guò)膠回收、克隆測(cè)序及Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該DNA片段與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的番木瓜（Carica papaya）、石榴（Punica granatum）、蕓香（Ruta graveolens）、山葡萄（Vitis amurensis）等植物的查爾酮合成酶的編碼序列相似性較高，推導(dǎo)的氨基酸序列也與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的CHS蛋白氨基酸序列的相似性也較高，由此可以初步推測(cè)分離所得DNA序列為辣木查爾酮合成酶的基因序列，并命名該基因?yàn)镸oCHS1。序列分析表明，以cDNA為模板擴(kuò)增得到的MoCHS1ORF序列長(zhǎng)度為1 185 bp，編碼394個(gè)氨基酸（圖2），以辣木基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的gDNA序列長(zhǎng)度為1 387 bp，兩者對(duì)比發(fā)現(xiàn)，MoCHS1基因中間具有一個(gè)內(nèi)含子（202 bp）序列，外顯子1為183 bp，外顯子2 為1 002 bp（圖1-B）。

圖1 辣木MoCHS1基因的克隆與結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Cloning and structure of MoCHS1 of M. oleifera

圖2 辣木MoCHS1 cDNA 核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Nucleic acid and putative amino acid sequence of MoCHS1 of M. oleifera

2.2 MoCHS1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

采用ProParam在線(xiàn)分析工具，對(duì)MoCHS1氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示MoCHS1的相對(duì)分子量為43.07 KD，等電點(diǎn)（pI）為5.84，分子式為：C1914H3 071N515O573S19，不穩(wěn)定指數(shù)為36.04＜40，脂肪族指數(shù)為93.83，總親水性平均值（GRAVY）為?0.067＜0，推測(cè)該蛋白為穩(wěn)定親水蛋白。在MoCHS1編碼的氨基酸中，含量最高的是亮氨酸和丙氨酸，分別占10.4%和9.1%，半胱氨酸和色氨酸所占比例最小，分別占1.8%和1.0%；其中帶負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp + Glu）總數(shù)50個(gè)，占氨基酸總數(shù)的12.7%，而帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)為44個(gè)，占氨基酸總數(shù)為 11.2%，推測(cè)該蛋白帶負(fù)電荷。

2.3 MoCHS蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

采用SignalP 5.0在線(xiàn)分析表明，辣木MoCHS1蛋白沒(méi)信號(hào)肽；Wolf-psort分析MoCHS蛋白的亞細(xì)胞定位顯示，在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體及液泡中均有分布，而以在細(xì)胞質(zhì)中分布為主。使用SOPMA工具進(jìn)行分析二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明MoCHS1蛋白以α-螺旋（45.43%）和不規(guī)則卷曲（31.98%）為主，其次有延伸鏈（16.75%）、β-轉(zhuǎn)角（5.84%）（圖3）。采用Swissmodel對(duì)MoCHS1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖4），結(jié)果與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相一致。

圖3 MoCHS1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析Fig. 3 Prediction and analysis on secondary structure of MoCHS1

圖4 MoCHS1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 4 Prediction of tertiary structure of MoCHS1

2.4 MoCHS的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAMAN9.0對(duì)推測(cè)的辣木MoCHS1的氨基酸序列與大豆（GmCHS,）、番木瓜（CpCHS）、擬南芥、煙草、葡萄、黃芩等植物CHS基因氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果（圖4）表明辣木MoCHS1與大豆、番木瓜、擬南芥、煙草、葡萄、黃芩的相似度分別為85%、88%、84.9%、85.9%、87.5%、81.3%。MoCHS1和其他植物中的CHS蛋白一樣，含有查爾酮合成酶基因家族高度保守的氨基酸殘基，包括7個(gè)環(huán)化袋氨基酸殘基、3個(gè)輔酶A活性結(jié)合位點(diǎn)、半胱氨酸（Cys）-組氨酸（His）-天冬氨酸（Asn）三聯(lián)體催化活性位點(diǎn)和CHS基因家族的2個(gè)高度保守氨基酸特征序列（RLMMYQQGCFAGGTVLR和GV LFGFGPGL）（圖5）。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明本研究所克隆的基因序列為辣木查爾酮合成酶基因序列。

圖5 辣木MoCHS1氨基酸序列與其他物種CHS氨基酸序列的多序列比對(duì)分析Fig. 5 Multiple alignment on amino acid sequences of CHS of M. oleifera and other species

運(yùn)用MEGA10.0軟件構(gòu)建辣木MoCHS1與大豆、擬南芥、煙草等29種植物CHS編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，MoCHS1與來(lái)源于番木瓜的CHS基因聚在一類(lèi)，說(shuō)明其親緣關(guān)系最近，與來(lái)源于破布葉、麻風(fēng)樹(shù)等植物CHS基因的進(jìn)化關(guān)系也較近，而與來(lái)源于玉米、水稻、小麥等單子葉植物的CHS基因進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

圖6 辣木MoCHS1與其他物種CHS的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 6 Phylogenic tree of putative amino acid sequences of MoCHS1 of M. oleifera and CHS of other species

3 討論與結(jié)論

查爾酮合成酶（CHS）屬于高等植物中高度保守的III 型聚酮體合成酶（polyketide synthase, PKS），是植物黃酮類(lèi)化合物合成途徑的第1個(gè)關(guān)鍵酶，參與重要中間產(chǎn)物查爾酮的形成[5，13，14]。前人研究表明，大部分植物的CHS基因家族均含有1個(gè)內(nèi)含子[8?10]。本研究根據(jù)NCBI中辣木基因組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，首次分別從cDNA和基因組DNA中分離獲得MoCHS1。序列分析表明，以cDNA為模板擴(kuò)增得到的MoCHS1 ORF序列長(zhǎng)度為1 185 bp，編碼394個(gè)氨基酸，以基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的gDNA序列長(zhǎng)度為1 387 bp，兩者對(duì)比發(fā)現(xiàn)，MoCHS1具有1個(gè)內(nèi)含子，結(jié)構(gòu)特征與基因大小與多數(shù)物種CHS的大小基本一致。MoCHS1蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊及不規(guī)則卷曲，其中α-螺旋是蛋白質(zhì)中最常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，不規(guī)則卷曲也是明確而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[15]。不同植物中的CHS基因在數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能上均存在差異[15]，MoCHS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋（45.43%）和不規(guī)則卷曲（31.98%）為主，β-轉(zhuǎn)角（5.84%）最少。MoCHS1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明，MoCHS1含有所有查爾酮合成酶基因家族中高度保守的特征氨基酸序列“GVLFGFGPGL”及活性氨基酸殘基位點(diǎn)，如輔酶A活性結(jié)合位點(diǎn)、Cys-His-Asn三聯(lián)體催化位點(diǎn)和環(huán)化袋等[16?18]。這些結(jié)構(gòu)特征表明本研究克隆的基因序列具備CHSs家族的共有特性，為辣木CHS的序列[5,11,13,16,17]。Blast在線(xiàn)分析也表明，辣木MoCHS推測(cè)的氨基酸序列與其他植物中的CHSs相似性較高，其中與來(lái)源于番木瓜、麻風(fēng)樹(shù)等藥用植物的CHSs的相似性均在85%以上，表明該基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查爾酮合成酶相關(guān)基因親緣關(guān)系越近。此外，3D結(jié)構(gòu)模型及系統(tǒng)進(jìn)化分析均證實(shí)MoCHS1與其他植物相一致。以上研究結(jié)果表明本研究中MoCHS1屬于典型的查爾酮合成酶家族基因。[11?14,19]

本研究首次克隆了辣木CHS1 基因的全長(zhǎng)ORF和gDNA序列，將有助于進(jìn)一步闡明辣木類(lèi)黃酮人化合物的合成及基調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，以期為利用生物技術(shù)手段改變植物類(lèi)黃酮化合物含量，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用辣木植物資源奠定理論基礎(chǔ)。