水稻葉綠體基因CPN60-β多克隆抗體的制備

蘭漢紅，陳?；?，黃偉鑫，何昕翼

（閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000）

0 引言

【研究意義】水稻條紋葉枯病是由水稻條紋病毒（Rice stripe virus, RSV）引起的重大病害，曾在中國16個(gè)省市和自治區(qū)暴發(fā)，給水稻生產(chǎn)帶來巨大危害，嚴(yán)重威脅著我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全[1]。然而，當(dāng)前對該病毒病的防控仍缺乏有效的措施。RSV屬于纖細(xì)病毒屬（Tenuivirus）病毒，其基因組為單鏈RNA（singal strain RNA, ssRNA）。對RSV的編碼策略研究表明，其基因組RNA1為負(fù)鏈編碼，RNA2、RNA3和RNA 4均為雙義編碼。RNA1互補(bǔ)鏈編碼復(fù)制相關(guān)蛋白R(shí)dRp[2]；RNA2毒義鏈及其互補(bǔ)鏈分別編碼沉默抑制子蛋白NS2和介體傳毒相關(guān)蛋白NSvc2[3]；RNA3毒義鏈及其互補(bǔ)鏈分別編碼沉默抑制子NS3和外殼蛋白CP[4?5]；RNA4毒義鏈及其互補(bǔ)鏈分別編碼病害特異蛋白SP和運(yùn)動(dòng)蛋白NSvc4[6?7]。病毒編碼的蛋白較少，為了完成復(fù)制循環(huán)，病毒常與寄主的蛋白因子相互作用。因此，加深RSV與寄主的互作對于病毒病害的綠色防控具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，小麥矮縮病毒的復(fù)制酶蛋白A與小麥文庫中的GRAB互作，GRAB的表達(dá)抑制小麥矮縮病毒在小麥種的復(fù)制增殖；唐超等[9]研究發(fā)現(xiàn)，小西葫蘆黃花葉病毒RNA多聚酶蛋白能夠與PABP氨基酸C端特異互作；Soellick等[10]研究發(fā)現(xiàn)，番茄斑萎病毒編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白NSm能夠與煙草和擬南芥的DnaJ蛋白特異互作；Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，番茄花葉病毒的外殼蛋白能夠與激發(fā)子反應(yīng)蛋白特異互作，該蛋白基因沉默后，病毒的外殼蛋白無法長距離運(yùn)動(dòng)，這結(jié)果說明兩者的特異互作對于病毒的運(yùn)動(dòng)是必須的；Desvoyes等[12]研究發(fā)現(xiàn)，番茄叢矮病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白P22能夠與亮氨酸拉鏈同源結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白特異互作，病毒的感染能夠顯著提高蛋白基因的表達(dá)水平?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人研究表明，RSV編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白NSvc4在模式植物煙草中參與病毒的長距離、胞間運(yùn)動(dòng)以及本氏煙感病癥狀的形成[8,13?15]，證明NSvc4參與病毒的運(yùn)動(dòng)和致病等侵染過程。但是NSvc4的運(yùn)動(dòng)或致病機(jī)制仍然不是很明確。在前期的酵母雙雜交試驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)NSvc4與水稻葉綠體相關(guān)的一個(gè)蛋白-RuBisCO亞基結(jié)合蛋白Chaperonin-60-beta（CPN60-β）能夠特異互作。猜測CPN60-β蛋白在NSvc4蛋白的運(yùn)動(dòng)和致病過程中發(fā)揮重要作用。但是，目前還缺乏針對CPN60-β的特異抗體，阻礙了對CPN60-β蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位情況、如何發(fā)揮功能等相關(guān)問題的探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】制備與RSV運(yùn)動(dòng)和致病過程有關(guān)的NSvc4蛋白的互作蛋白水稻葉綠體蛋白的RuBisCO亞基結(jié)合蛋白Chaperonin-60-beta（CPN60-β）多克隆抗體。明確CPN60-β基因原核表達(dá)條件，獲得水稻葉綠體CPN60-β蛋白的多克隆抗體，用于后續(xù)研究CPN60-β蛋白在RSV編碼的NSvc4蛋白介導(dǎo)的病毒運(yùn)動(dòng)和致病過程中的調(diào)控功能及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

原核表達(dá)載體pET-28a（+）由本課題組實(shí)驗(yàn)室保存。植物組織總RNA快速提取試劑盒（RNA Easy Fast Plant Tissue Kit）和 質(zhì) 粒 小 量 快 速 抽 提 試 劑 盒（TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit）等購自北京天根生化科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶和聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastKing One Step RT-PCR Kit）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；弗氏佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司；鼠源6×His單克隆抗體購自美國Proteintech Group公司。

1.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建

將水稻葉綠體相關(guān)基因CPN60-β序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行同源性比對，以Primer5.0設(shè)計(jì)特異性引物CPN60-β-Forward：5′-TATAGGATCCACCGCA AAAGCACTG GTT G-3′（斜體加下劃線字體為酶切位點(diǎn)BamHI，加粗字體為保護(hù)堿基）和CPN60-β-Reverse：5′ -TA TACTCGAGGCGCTCGTTCAGTTTCTC-3′（斜體加下劃線字體為酶切位點(diǎn)XhoI，加粗字體為保護(hù)堿基）。用植物組織總RNA快速提取試劑盒提取水稻幼嫩葉片總RNA后，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體 系50 μL：RNA模 板0.1 μg，RT-PCR MasterMix buffer 25 μL，RT-PCR Enzyme Mix buffer 2 μL，上下游引物各1.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。PCR反應(yīng)條件：42 ℃ 30 min；95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 40 s、70 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)；70 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-28a（+）都用BamH ?和XhoI進(jìn)行37 ℃雙酶切過夜。酶切體系為：RT-PCR產(chǎn)物或者 表達(dá)載體質(zhì) 粒2 μL，Buffer 1 μL，BamH ?和XhoI各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。酶切產(chǎn)物回收后與T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜，連接體系為：表達(dá)載體質(zhì)粒3 μL，RT-PCR酶切產(chǎn)物5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，Buffer 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。連接后，將產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸感覺感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布LB瓊脂培養(yǎng)平板，然后挑取培養(yǎng)平板單克隆進(jìn)行PCR和測序驗(yàn)證，正確的重組表達(dá)載體命名為pET-CPN60-β。

1.3 CPN60-β基因的原核表達(dá)與檢測鑒定

將重組表達(dá)載體pET-CPN60-β熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞并涂布于含卡那霉素（50 μg·mL?1）的LB固體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆接種到LB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg·mL?1）中，37 ℃、220 r·min?1振蕩培養(yǎng)12 h。第2 d按照1∶100倍比稀釋后置于37 ℃、220 r· min?1振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600約為0.6～0.8），添加誘導(dǎo)劑IPTG 0.5 mmol·L?1，在37 ℃和220 r· min?1振蕩培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)目的基因表達(dá)3.5 h。12 000 r·min?1離心沉淀細(xì)胞，超聲波裂解細(xì)胞適當(dāng)時(shí)間，SDS-PAGE凝膠電泳跑膠，將膠進(jìn)行考馬斯染色初步確定CPN60-β基因是否表達(dá)。pET-CPN60-β重組質(zhì)粒帶有6×His標(biāo)簽，如果CPN60-β基因成功表達(dá)，那么CPN60-β蛋白和6×His能夠融合表達(dá)，所以可以用His抗體檢測鑒定目的基因是否成功表達(dá)。不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)pET-CPN60-β重組載體后，收集菌體蛋白進(jìn)行Western blotting檢測目的蛋白是否成功表達(dá)。以抗6×His抗體為一抗、辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記抗體為二抗，進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，鑒定CPN60-β蛋白是否融合6×His標(biāo)簽，從而進(jìn)一步鑒定CPN60-β基因是否表達(dá)。在SDS-PAGE和Western blot試驗(yàn)過程中均設(shè)置不加IPTG的對照組。

1.4 抗血清的制備、純化、效價(jià)和濃度測定

純化CPN60-β蛋白，將其和一定量的弗氏完全佐劑充分混勻和乳化，乳化后免疫5月齡的雄性新西蘭大白兔；隨后每隔15 d加強(qiáng)免疫4～5次。為了監(jiān)測免疫過程中是否產(chǎn)生抗體，在蛋白免疫前和第2次加強(qiáng)免疫后第15 d分別抽血采樣15 mL，將血液樣品在4 ℃冰箱靜止保存過夜。為了收集血樣中的抗血清，將血樣在8 000 r min?1離心20 min。隨后，將抗血清按照1∶500、1∶2 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶100 000和1∶1 000 000的稀釋比例稀釋，然后在室溫條件下孵育一抗60 min，孵育二抗 50 min，顯色30 min。

在第4次加強(qiáng)免疫后15 d，采集兔子全血60 mL，按上述方法獲取血清。將蛋白Beads添加至純化柱子后，收集好的抗血清添加至柱子內(nèi)部，室溫條件下或者4 ℃冰箱和Beads共孵育；孵育結(jié)束后用PBS緩沖液沖洗5次；然后用洗脫液洗脫收集抗血清蛋白。采用上述ELISA方法檢測純化后抗血清的效價(jià)。將CPN60-β融合蛋白免疫大白兔前所采的血設(shè)為陰性對照。為了避免動(dòng)物死亡，設(shè)置2個(gè)平行試驗(yàn)，即免疫2只動(dòng)物。

抗體結(jié)構(gòu)中重鏈和輕鏈分子大小分別為55 kDa和25 kDa，因此，可通過還原性SDS-PAGE分離后考馬斯顯色觀察抗體重蓮含量來檢測抗體的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因CPN60-β的擴(kuò)增與表達(dá)載體構(gòu)建

以水稻幼嫩葉片總RNA為模板、CPN60-β-Forward/CPN60-β-Reverse為引物，RT-PCR擴(kuò)增水稻葉綠體基因CPN60-β。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，目的基因片段CPN60-β的大小大約為657 bp（圖1-A）。目的基因經(jīng)過克隆轉(zhuǎn)化后，任意選取LB固體培養(yǎng)基平板上的單克隆菌落，PCR鑒定陽性單菌落。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，成功重組的質(zhì)粒pET-CPN60-β能夠擴(kuò)增出大小約為657 bp的目的基因CPN60-β片段（圖1-B）。陽性重組質(zhì)粒pET-CPN60-β送至廣州生工基因股份有限公司測序，以驗(yàn)證序列正確與否。

圖1 重組質(zhì)粒pET-CPN60-β構(gòu)建Fig. 1 Construction of recombinant plasmid pET-CPN60-β

2.2 葉綠體基因CPN60-β的表達(dá)與鑒定

重組質(zhì)粒pET-CPN60-β轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21后，為了明確CPN60-β基因是否在大腸桿菌BL21能夠誘導(dǎo)表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)條件設(shè)置為：誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.5 mmol·L?1、搖床溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速220 r· min?1、振蕩培養(yǎng)3.5 h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，在此誘導(dǎo)表達(dá)條件下，重組質(zhì)粒表達(dá)約30 kDa的蛋白條帶，而不添加IPTG的對照中并未出現(xiàn)特異蛋白條帶（圖2-A），該結(jié)果初步表明重組質(zhì)粒pET-CPN60-β能夠表達(dá)分子量約30 kDa的CPN60-β融合蛋白。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CPN60-β是否表達(dá)，以抗6×His抗體為一抗、辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記抗體為二抗進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，結(jié)果表明，在誘導(dǎo)表達(dá)組中，在30 kDa處6×His抗體能夠特異結(jié)合其抗原6×His進(jìn)而顯色，而不添加IPTG的對照中在相應(yīng)位置并未結(jié)合和顯色（圖2-B）。因?yàn)镃PN60-β融合了6×His，所以該結(jié)果進(jìn)一步表明CPN60-β融合蛋白能夠成功誘導(dǎo)表達(dá)。

圖2 CPN60-β基因的表達(dá)與鑒定Fig. 2 Expression and confirmation of CPN60-β gene

2.3 抗CPN60-β抗體的效價(jià)和濃度

為了監(jiān)測免疫過程中是否產(chǎn)生抗CPN60-β多克隆抗體，在蛋白免疫前和第2次加強(qiáng)免疫后采集少量血樣，收集血清，倍比稀釋后采用ELISA檢測免疫前和加強(qiáng)免疫后（未純化）的抗血清效價(jià)。ELISA檢測結(jié)果表明，與免疫前和空白對照相比，未純化加強(qiáng)免疫后的抗血清隨著稀釋比例加大，ELISA顯色越來越弱；稀釋比例達(dá)到1∶1 000 000顯色反應(yīng)仍然可見（圖3-A），表明未純化的加強(qiáng)免疫后抗血清的效價(jià)為1∶1 000 000。

為了明確多克隆抗體純化前后的效價(jià)，多克隆抗體經(jīng)親和配體純化、倍比稀釋后，以ELISA檢測其抗體效價(jià)。ELISA檢測結(jié)果顯示，與純化前的抗血清對照相比，在相同倍比稀釋下，純化后的抗體ELISA顯色反應(yīng)明顯比較深，該結(jié)果說明抗體經(jīng)過純化后其濃度得到有效的提高（圖3-B）。此外，多克隆抗體純化前后在倍比稀釋達(dá)到1∶1 000 000時(shí)，ELISA顯色反應(yīng)仍然較為明顯，說明純化后的抗體效價(jià)都達(dá)到1∶1 000 000（圖3-B）。然而，洗脫液ELISA反應(yīng)不顯色，表明抗體大部分被純化（圖3-B）。

圖3 抗CPN60-β抗體的效價(jià)測定Fig. 3 Titer of antibodies against CPN60-β

抗體結(jié)構(gòu)中重鏈和輕鏈分子大小分別為55 kDa和25 kDa。因此，抗體通過變性或還原性SDS-PAGE分離后考馬斯顯色可觀察抗體重鏈含量從而檢測抗體的濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測后抗體的含量約為300 μg·mL?1（圖4）。

圖4 變性SDS-PAGE檢測抗CPN60-β抗體濃度Fig. 4 Antibody concentration estimated by denatured SDSPAGE

3 討論

前人的研究結(jié)果表明，RSV編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白NSvc4在模式植物煙草中參與病毒的長距離、胞間運(yùn)動(dòng)，以及本氏煙感病癥狀的形成[8,13?14]，證明NSvc4參與病毒的運(yùn)動(dòng)和致病等侵染過程。但是NSvc4的運(yùn)動(dòng)或致病機(jī)制仍未明確。因此，加深NSvc4與寄主水稻的互作機(jī)理的研究和了解，對于病毒侵染機(jī)制和病毒病害的綜合綠色防治具有重要意義。病毒編碼的蛋白數(shù)量有限，其必須招募或者利用寄主細(xì)胞內(nèi)的蛋白來完成侵染過程。筆者在酵母雙雜交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NSvc4與水稻葉綠體相關(guān)的一個(gè)蛋白——RuBisCO亞基結(jié)合蛋白Chaperonin-60-beta（CPN60-β）能夠特異互作。因此，猜測CPN60-β蛋白在NSvc4蛋白介導(dǎo)的RSV在寄主中的運(yùn)動(dòng)和致病過程中發(fā)揮重要作用。但是，目前還缺乏針對CPN60-β蛋白的特異抗體，阻礙了CPN60-β蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位、發(fā)揮作用機(jī)制等問題的研究。本試驗(yàn)制備的水稻CPN60-β多克隆抗體有助于研究CPN60-β蛋白在RSV病毒運(yùn)動(dòng)和致病過程中的功能。

目前，通過蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體的方法具有成熟、簡單，周期短等優(yōu)點(diǎn)[15]。多克隆抗體能夠制備成功的關(guān)鍵點(diǎn)為能否正確選取抗原蛋白的抗原片段[16]。本研究首先通過分析水稻CPN60-β蛋白分子的抗原指數(shù)、可及性、親水性和疏水性等特性，選取抗原指數(shù)較高的179～422 aa區(qū)段作為抗原。然后擴(kuò)增目的基因CPN60-β，且成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-CPN60-β并進(jìn)行高效表達(dá)，獲得的CPN60-β融合蛋白經(jīng)Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析純化后作為抗原免疫雄性新西蘭大白兔，成功制備獲得抗水稻CPN60-β多克隆抗體，并證實(shí)制備獲得的CPN60-β多克隆抗體純度較高，其質(zhì)量濃度和效價(jià)分別為300 μg mL?1和1∶1 000 000。CPN60-β抗體的制備為后續(xù)進(jìn)一步研究CPN60-β在NSvc4介導(dǎo)的RSV運(yùn)動(dòng)和致病過程中發(fā)揮的具體機(jī)制提供了重要材料。稻谷等糧食是人類賴以生存和發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。病毒病一直嚴(yán)重影響著我國水稻等糧食生產(chǎn)和糧食安全。糧食安全是關(guān)乎國計(jì)民生的頭等大事，我國農(nóng)業(yè)病蟲害多發(fā)，嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量。CPN60-β抗體的制備將有助于加深對RSV NSvc4及其CPN60-β在病毒致病過程中的具體作用機(jī)制的理解，并可望通過設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)開發(fā)出針對水稻病毒病的綠色防控技術(shù)。