牡荊苷對MPTP 誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)及腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響

黃 鑫楊增艷黎 麗陳少鋒

(廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院(壯瑤醫(yī)藥研究實驗室,廣西現(xiàn)代壯醫(yī)藥工程研究中心),南寧 530200)

帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一種好發(fā)于中老年人群中的進行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,主要臨床表現(xiàn)為運動功能障礙、靜息震顫、僵硬,且伴隨抑郁、乏力、睡眠障礙,給患者身心健康造成極大影響[1]。 2018 年,全球共有 PD 患者近 11 億人,男性高于女性。 據(jù)統(tǒng)計,我國65 歲以上老年人群中,PD的發(fā)病率約為1.7%,且隨年齡增長其發(fā)病率也呈增加趨勢[2]。 目前,包括美多芭、苯海索、恩他卡朋等西藥是PD 患者常用的治療藥物,但這些藥物只能減緩癥狀,并不能根治疾病,短期內(nèi)療效較好,但長期用藥容易療效減退,故而尋找治療PD 的新藥物顯得尤為迫切。

PD 致病因素較多,發(fā)病機制也極為復(fù)雜,而氧化應(yīng)激在PD 發(fā)病過程中扮演極為關(guān)鍵的作用[3]。氧化應(yīng)激是機體受到刺激后,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)大量生成,打破了機體氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡,從而對組織和細胞產(chǎn)生損傷的反應(yīng)過程。 由于腦組織富含對自由基敏感的多不飽和脂肪酸,故而容易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。 研究證實,腦內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS 過度蓄積,可引起中腦黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元凋亡,DA 數(shù)量的減少,引起了腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA 分泌減少,從而產(chǎn)生一系列運動障礙癥狀[4]。 因此,抑制氧化應(yīng)激可能會對腦內(nèi)DA 神經(jīng)元凋亡保護取得一定效果。

牡荊苷是分布于金蓮花、布渣、山楂、光果甘草等多種植物中的黃酮碳苷類化合物,具有保護心腦血管、抑制神經(jīng)炎癥、抑制骨溶解和抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用[5-6]。 但迄今為止,尚未見牡荊苷對PD的研究報道。 研究報道,牡荊苷在急性腦缺血再灌注、異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡模型、肺損傷中均有抗氧化應(yīng)激的作用[4,7-8]。 那么牡荊苷能否通過抑制氧化應(yīng)激,從而對PD 神經(jīng)元凋亡損傷產(chǎn)生保護作用值得深入研究。 為此,本研究制備PD 模型小鼠,探討牡荊苷對小鼠行為學(xué)、腦內(nèi)黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元和氧化應(yīng)激損傷的保護作用,為牡荊苷的應(yīng)用提供研依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

32 只 SPF 級雄性 C57BL/6 小鼠,體重22~24 g,2~ 3 月齡,購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(桂)2019-0002]。 小鼠在廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院明秀分院實驗動物房分籠飼養(yǎng)和取材[SYXK(桂)2019-0001],允許自由飲水,普通飼料喂養(yǎng),飼養(yǎng)溫度為(20±2)℃,相對濕度36%,12 h 晝夜節(jié)律。本次動物實驗研究經(jīng)廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審批通過(GZL2020-019),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,批號:A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽-過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSHPx,批號:A003 - 1 - 1)、5-羥色胺(5-HT,批號:H104)、DA(批號:H170)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE,批號:H240)、原位末端標記(TdT-mediated dUTP nick and labeling,TUNEL,批號:G002-1-2)試劑盒均購自南京建成生 物 工 程 研 究 所; 二 羥 基 苯 乙 酸( dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC, 批 號:kt21794)、高香草酸(Homovanillic acid,HVA,批號:kt21801)、 胱 抑 素 C (cystatin C, Cys-C, 批 號:kt30088)ELISA 檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司;B 淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2,批號:ab194583)、凋亡相關(guān)因子Bcl-2 相關(guān)X蛋 白 ( Bcl-2 associated X protein, Bax, 批 號:ab182733)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteine aspartic acid protease-3,Caspase-3,批號:ab184787)和β-肌動蛋白(β-actin,批號:ab6276)單克隆抗體均購自英國Abcam 公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate.polyacrylamide gel electmphoresis,SDS-PAGE,批號:P0670)凝膠配置試劑盒、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號:P0012S)和聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF,批號:FFP24)均購自江蘇碧云天生物公司;牡荊苷(HPLC≥95%,批號:11027-63-7)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶 ( 1 - methyl-4 - phenyl-1, 2, 3, 6 -tetrahydropyridine,MPTP,批號:5063820001) 購于Sigma 公司;美多芭片(批號:981969),上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、造模及藥物干預(yù)

32 只小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥物(美多芭)組、牡荊苷組,每組8 只。 空白組注射生理鹽水,其余各組均按30 mg/kg 劑量腹腔注射MPTP(40 mg/mL),連續(xù)7 d。 建模成功后,美多芭組灌胃1.67 mg/kg 美多芭片,牡荊苷組灌胃20 mg/kg 牡荊苷,空白組、模型組灌胃等量生理鹽水,連續(xù)治療30 d。

1.3.2 行為學(xué)檢測

在造模前,造模后、治療后分別對各組小鼠的以下行為學(xué)進行檢測。 每只小鼠測試之前每天訓(xùn)練 3 次,連續(xù) 3 d。

(1)爬桿實驗

制作一個直徑為1 cm、長0.6 m 的光滑不銹鋼桿,在桿中央做一條標記線,將桿垂直固定于一水平平面,將小鼠頭向下放置在桿的頂部,使其沿桿自然爬下,對小鼠下滑行為進行評分,爬桿實驗評分標準:0 分,四肢并用,一次順利從桿上爬下;0.5 分,一次性從桿上爬下,但后肢出現(xiàn)滑行;1分,上桿后停頓數(shù)次后爬下;1.5 分,滑行后滑落,有輕微震顫;2 分,震顫明顯,四肢僵直,不能抓桿,直接掉落;2.5 分,連續(xù)震顫,四肢麻痹,不能活動或死亡[9]。

(2)游泳實驗

在長90 cm,寬80 cm 的玻璃水箱中注入水,使水深達到20 cm,水溫為(25±2)℃,進行1 min 游泳實驗。 游泳實驗評分標準:3 分,期間持續(xù)游泳;2.5分,期間大部分時間游泳;2 分,期間一般以上時間在游泳;1.5 分,偶爾游泳;1 分,偶爾用后肢游泳;0.5 分,出現(xiàn)連續(xù)震顫,不能活動或死亡[9]。

1.3.3 組織取材

行為學(xué)觀察結(jié)束后,小鼠用2%戊巴比妥鈉按1.5 mL/kg 劑量腹腔注射麻醉,取外周血后,脫頸椎處死小鼠,取含腦黑質(zhì)的腦組織,置于4%多聚甲醛中固定,部分大腦黑質(zhì)置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清Cys-C、NSE 和腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量

將各組小鼠外周血在4℃條件下,以3000 r/min離心10 min,分離血清。 取小鼠腦組織進行組織勻漿,超聲破碎,在4℃條件下,以10000 r/min 離心20 min,去上清。 嚴格按照試劑盒操作說明,采用ELISA 法檢測血清中Cys-C、NSE 含量,以及腦組織中 DA、DOPAC、HVA、5-HT 含量。

1.3.5 分光光度法檢測腦組織中SOD、MDA、GSHPx 含量

取分離得到的腦組織勻漿上清,根據(jù)試劑盒操作說明檢測腦黑質(zhì)勻漿上清液中 MDA、SOD 及GSH-Px 的水平。

1.3.6 Tunel 染色檢測腦黑質(zhì)中DA 能神經(jīng)元細胞凋亡水平

取固定腦組織,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,行4 μm 切片,常規(guī)脫蠟至水,滴加 20 μg/mL 現(xiàn)配的蛋白酶K,37℃孵育20 min,PBS 洗滌,1%山羊血清封閉30 min,使TdT 酶反應(yīng)液覆蓋載玻片,37℃孵育20 min,辣根過氧化物酶(HRP)孵育,PBS 洗滌,滴加DAB 染色1 min,流水沖洗,蘇木素復(fù)染、二甲苯脫水透明,中心樹膠封片,在400 倍顯微鏡下觀察采集圖像,細胞核呈棕色表示陽性細胞。 在6 個視野下計數(shù)計算平均陽性率。

1.3.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測腦黑質(zhì)中 Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達

取小鼠腦組織,用預(yù)冷的裂解液提取總蛋白,BCA 法對各組蛋白樣品進行定量,取50 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳,電泳結(jié)束后,將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,用 Bcl-2(1 ∶2000)、Bax(1 ∶1000)、Caspase-3(1 ∶2000) 抗體于4℃孵育過夜,TBST 洗滌,用HRP 標記的二抗室溫孵育1 h,TBST 洗滌后,化學(xué)發(fā)光顯影,凝膠圖像處理系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以平均數(shù)±標準差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗(LSD-t)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牡荊苷對小鼠行為學(xué)的影響

各組小鼠造模前爬桿實驗和游泳實驗評分比較,均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);造模后,與空白組相比,模型組、美多芭組、牡荊苷組小鼠爬桿實驗評分顯著升高(P<0.05),游泳實驗評分顯著降低(P<0.05);治療后,與模型組相比,牡荊苷組小鼠爬桿實驗評分顯著降低(P<0.05),游泳實驗評分顯著升高(P<0.05),與美多芭組相比,牡荊苷組小鼠爬桿實驗和游泳實驗評分無顯著差異(P>0.05),見圖1。

圖1 牡荊苷對小鼠行為學(xué)的影響(,n=8)Note. A, Climbing experiment score. B, Swimming experiment score. Compared with control group,**P<0.01. Compared with model group,#P<0.05.Figure 1 Effect of vitexin on the behavior of mice

2.2 牡荊苷對小鼠血清中Cys-C 和NSE 水平的影響

ELISA 實驗結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組小鼠血清中Cys-C 水平降低,NSE 水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,美多芭組、牡荊苷組小鼠血清中Cys-C 水平升高,NSE 水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與美多芭組相比,牡荊苷組小鼠血清中Cys-C 和NSE 水平無顯著性差異(P>0.05),見圖 2。

圖2 牡荊苷對小鼠血清中Cys-C 和NSE 的影響(,n=8)Note. A,Levels of Cys-C and NSE in mice serum. B,Levels of NSE in mice serum. Compared with control group,**P<0.01. Compared with model group,##P<0.01.Figure 2 Effect of vitexin on the the levels of Cys-C and NSE in mice serum

2.3 牡荊苷對小鼠腦黑質(zhì)中 DA、DOPAC、HVA和5-HT 水平的影響

與空白組比較,模型組小鼠腦黑質(zhì)中神經(jīng)遞質(zhì)DA、OPAC、HVA 和 5-HT 水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組比,美多芭組、牡荊苷組小鼠腦黑質(zhì)中 DA、OPAC、HVA 和 5-HT 水平升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與美多芭組相比,牡荊苷組小鼠腦黑質(zhì)中5-HT 水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),見表 1。

表1 牡荊苷對兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響(,n=8)Table 1 Effects of vitexin on the levels of catecholamine neurotransmitters

表1 牡荊苷對兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響(,n=8)Table 1 Effects of vitexin on the levels of catecholamine neurotransmitters

注:與空白組比,**P<0.01;與模型組比,##P<0.01,#P<0.05;與美多芭組比,&P<0.05。Note. Compared with control group,**P<0.01. Compared with model group,##P<0.01,#P<0.05. Compared with pramipexole group,&P<0.05.

組別 Groups DA(μg/L) DOPAC(μg/L) HVA(μg/L) 5-HT(μg/L)空白組 Control group 4.36±0.24 26.16±2.76 31.40±4.05 3.57±0.27模型組 Model group 1.96±0.52** 16.16±2.47** 21.00±2.22** 2.48±0.28**美多芭組 Pramipexole group 2.44±0.37# 18.18±1.35# 24.46±3.36# 2.80±0.15#牡荊苷組 Vitexin group 2.75±0.37## 18.96±1.42# 25.29±3.52# 3.12±0.29##&

2.4 牡荊苷對小鼠腦黑質(zhì)中SOD、MDA、GSH-Px水平的影響

與空白組比,模型組小鼠腦黑質(zhì)中 SOD 和GSH-Px 水平降低,MDA 水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,美多芭組、牡荊苷組小鼠腦黑質(zhì)中SOD 和GSH-Px 水平升高,MDA 水平降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01 或P<0.05);與美多芭組相比,牡荊苷組小鼠腦黑質(zhì)中 SOD 和GSH-Px 水平升高,MDA 水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),見表2。

表2 牡荊苷對氧化應(yīng)激因子水平的影響(,n=8)Table 2 Effects of vitexin on the levels of oxidative stress factor

表2 牡荊苷對氧化應(yīng)激因子水平的影響(,n=8)Table 2 Effects of vitexin on the levels of oxidative stress factor

注:與空白組比,**P<0.01;與模型組比,##P<0.01,#P<0.05;與美多芭組比,&P<0.05。Note. Compared with control group,**P<0.01. Compared with model group,##P<0.01,#P<0.05. Compared with pramipexole group,&P<0.05.

組別Groups SOD(U/mg) MDA(mmol/mg) GSH-Px(U/mg)空白組 Control group 184.37±9.30 2.15±0.19 74.97±3.19模型組 Model group 115.10±12.84** 6.34±0.58** 45.8±8.08**美多芭組 Pramipexole group 149.88±7.69## 4.65±0.60## 52.10±3.83#牡荊苷組 Vitexin group 163.83±15.81##& 4.08±0.38##& 57.02±7.17##&

2.5 牡荊苷對小鼠腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元凋亡率的影響

與空白組比,模型組小鼠腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);與模型組比,美多芭組、牡荊苷組小鼠腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡率降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與美多芭組比,牡荊苷組小鼠腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),見圖3。

圖3 牡荊苷對小鼠腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元凋亡率的影響(,n=8)Note. A, Control group. B, Model group. C, Pramipexole group. D, Vitexin group. Compared with control group,**P<0.01. Compared with model group,##P<0.01,#P<0.05. Compared with pramipexole group,&P<0.05.Figure 3 Effects of vitexin on the apoptosis rate of neurons in mice

2.6 牡荊苷對小鼠腦黑質(zhì)中 Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達的影響

與空白組比,模型組小鼠腦黑質(zhì)中Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達量升高,降低,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);與模型組比,美多芭組、牡荊苷組小鼠腦黑質(zhì)中Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達降低,Bcl-2 蛋白表達量升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05);與美多芭組比,牡荊苷組小鼠腦黑質(zhì)中 Bax、Cleaved caspase-3 蛋白水平降低,Bcl-2 蛋白表達量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),見圖4。表明美多芭和牡荊苷均能提高PD 模型小鼠腦黑質(zhì)中 Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達,并降低 Bcl-2 蛋白表達量,且牡荊苷調(diào)控作用優(yōu)于美多芭。

圖4 牡荊苷對小鼠腦黑質(zhì)中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達的影響(,n=8)Note. Compared with control group,**P<0.01. Compared with model group,##P<0.01. Compared with pramipexole group,&P<0.05.Figure 4 Effects of vitexin on the expression of Bcl-2, Bax and Cleaved caspase-3 proteins of neurons in mice

3 討論

PD 是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,以震顫,僵直,運動遲緩和步態(tài)失調(diào)伴姿勢不穩(wěn)等運動障礙為主要臨床表現(xiàn)。 美多芭是老年P(guān)D 患者的常用藥,患者長期服用該藥物后療效會越來越差,且藥物的不良反應(yīng)明顯。 因此,開發(fā)安全、有效的治療PD 的藥物迫在眉睫。 已有研究表明,牡荊苷對MPTP 誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細胞瘤細胞毒性和細胞增殖有抑制作用,并對急性腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能具有保護作用[10]。 然而牡荊苷對PD 引起的運動功能障礙和神經(jīng)功能損傷的保護作用鮮有報道。 本實驗著重探討牡荊苷對MPTP 誘導(dǎo)PD 模型小鼠的保護作用以及機制。

爬桿實驗和游泳實驗是PD 動物模型最常用的行為學(xué)檢測方法,對動物協(xié)調(diào)運動能力具有較好的檢測效果。 研究證實MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠模型由于紋狀體DA 的特異性改變,可出現(xiàn)與人類PD 患者類似的運動障礙[11]。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組小鼠爬桿實驗評分顯著升高,游泳實驗評分顯著降低,說明PD 模型制備成功,符合PD 臨床癥狀。 經(jīng)過牡荊苷和美多巴干預(yù)后,爬桿實驗評分降低,游泳實驗評分升高,表明牡荊苷對PD 小鼠的運動功能障礙具有保護作用。

Cys-C 是半胱氨酸蛋白酶的抑制劑,屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族Ⅱ家族成員,其廣泛存在于哺乳動物各種組織的有核細胞和體液中,其水平增加可以保護神經(jīng)元免受外源性刺激造成的細胞毒性傷害[12]。 NSE 是烯醇化酶基因超家族成員之一,存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞胞質(zhì)內(nèi)[13]。 神經(jīng)元損傷后,神經(jīng)細胞將NSE 分泌到細胞外,其水平隨著神經(jīng)退行性紊亂的進展而增加。 神經(jīng)遞質(zhì)DA、DOPAC、HVA、5-HT 含量的變化是 PD 臨床診斷的主要指標之一,也是評價治療是否有效的客觀指標。 PD 發(fā)生后紋狀體中DA 的進行性下降是引起運動癥狀的主要原因,而HVA 和DOPAC 是DA的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物,游離的HVA 和DOPAC 具有神經(jīng)毒性,其可加重神經(jīng)元細胞損傷[14]。 5-HT神經(jīng)元胞體內(nèi)神經(jīng)纖維廣泛分布,其可以吸收外源左旋多巴藥物并轉(zhuǎn)化為DA。 當5-HT 能系統(tǒng)傳遞功能發(fā)生障礙時將引起靜息震顫并誘發(fā)運動障礙。為了進一步闡明牡荊苷對PD 的治療效果,檢測了各組小鼠上述指標的變化情況。 結(jié)果顯示,與空白組小鼠相比,模型組小鼠血清Cys-C 含量顯著減少,而NSE 含量顯著增加,提示PD 模型的神經(jīng)細胞受損明顯。 用牡荊苷和美多巴治療后,血清Cys-C 含量顯著升高,NSE 含量顯著降低,說明牡荊苷對PD模型小鼠神經(jīng)元損傷具有一定的保護作用。 此外,模型組小鼠的 DA、DOPAC、HVA、5-HT 含量比正常小鼠顯著減少,進一步說明PD 模型的神經(jīng)細胞受損明顯。 經(jīng)過牡荊苷和美多巴干預(yù)后,DA、DOPAC、HVA、5-HT 水平升高。 以上實驗結(jié)果表明牡荊苷對PD 模型小鼠神經(jīng)遞質(zhì)變化有調(diào)節(jié)作用。

氧化應(yīng)激損傷被認為是PD 中導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變的重要原因[15]。 在PD 患者病情進展中腦組織氧自由基大量產(chǎn)生和氧自由基清除系統(tǒng)的缺陷可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡。 MDA 是脂質(zhì)過氧化醛類最終產(chǎn)物之一,可反映氧自由基水平和反映細胞損傷的程度。 SOD 和GSH-Px 是機體重要的抗氧化酶,能清除超氧陰離子自由基和脂質(zhì)過氧化物,具有保護細胞免受氧化損傷的作用[16],其含量和活性降低可導(dǎo)致體內(nèi)的氧自由基清除障礙,加劇其對神經(jīng)的毒性作用。 本研究發(fā)現(xiàn)PD 小鼠MDA 水平比正常小鼠顯著增加,而SOD 和GSH-Px 水平比正常小鼠顯著減少,說明PD 小鼠的神經(jīng)細胞受到了氧化應(yīng)激損害。 給予PD 小鼠牡荊苷和美多巴后能提高腦黑質(zhì) SOD 和 GSH-Px 的含量,降低 MDA 水平,改善腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的氧化應(yīng)激狀態(tài),從而起到保護腦的作用,提示牡荊苷通過改善氧化應(yīng)激損傷對PD 產(chǎn)生治療效應(yīng)。

PD 發(fā)病過程與黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細胞凋亡關(guān)系密切,過多的神經(jīng)細胞凋亡則會導(dǎo)致神經(jīng)功能受到影響。 Bcl-2 家族是已知細胞凋亡中最重要的調(diào)控因子,Bcl-2 基因表達上升可抑制細胞凋亡,而Bax 基因表達上升可誘導(dǎo)細胞凋亡。 此外,Caspase-3 作為Caspase 家族成員之一,是細胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行基因。 通常情況下,Caspase-3 以非活化形式存在,當細胞凋亡途徑激活后,Caspase-3 磷酸化為Cleaved caspase-3,細胞凋亡進入不可逆階段。 Bcl-2/Bax 的比值降低導(dǎo)致線粒體膜電位下降,破壞了線粒體膜完整性和功能,從而導(dǎo)致細胞色素c 等凋亡因子釋放,激活下游Caspase-3[17]。 本實驗結(jié)果可知,模型組小鼠腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元凋亡率比正常組顯著增加,Cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表達顯著升高,Bcl-2 蛋白表達顯著下降,說明PD 模型的神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡;經(jīng)過牡荊苷和美多巴治療后,小鼠多巴胺能神經(jīng)元凋亡水平下降,推測牡荊苷和美多巴可能通過上調(diào)Bcl-2 蛋白表達,下調(diào)Bax 蛋白表達,從而減少Cleaved caspase-3 活化,抑制腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元凋亡,最終起抑制腦損傷作用。 此外,牡荊苷抗神經(jīng)元凋亡作用顯著優(yōu)于美多巴,這進一步提示牡荊苷對PD 模型小鼠神經(jīng)元凋亡具有保護作用。

綜上所述,牡荊苷對MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型小鼠具有一定的神經(jīng)保護作用,體現(xiàn)為減緩運動功能障礙和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)變化,作用機制與抑制多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷和減少神經(jīng)元凋亡有關(guān),其可能成為防治PD 的有效藥物。