參芪地黃湯對糖尿病腎病模型大鼠腎組織中TGF-β1及VEGF表達(dá)的影響

瞿 飛 高金梅 趙 杰 廖加抱

（1.嘉興市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 嘉興 314001；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；3.云南中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021）

糖尿病可引起腎功能衰退，最終發(fā)展為糖尿病腎病（DN）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病患者中約有25%～50%會(huì)出現(xiàn)DN，長期的DN會(huì)發(fā)展為腎衰竭，嚴(yán)重威脅患者生命[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的異常表達(dá)是糖尿病出現(xiàn)腎損傷的重要機(jī)制之一，通過調(diào)控TGF-β1與VEGF表達(dá)，可改善DN患者腎功能[2-3]。近年來，中藥治療DN取得了十分顯著的療效[4-5]。參芪地黃湯最早記載于《雜病源流犀燭》，臨床可用于治療脾腎虧虛、氣陰不足型DN[6]，但其緩解DN的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過建立大鼠DN模型，灌胃不同劑量參芪地黃湯，觀察參芪地黃湯對DN模型大鼠的治療作用，同時(shí)檢測大鼠腎組織VEGF及TGF-β1表達(dá)水平，探索參芪地黃湯緩解DN的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購于北京華阜康生物科技有限公司。大鼠飼養(yǎng)于SPF級清潔環(huán)境中，自由進(jìn)食，室溫（22±2）℃。本研究經(jīng)嘉興市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意。

1.2 主要試劑及儀器 鹽酸貝納普利片（諾華制藥有限公司）；高糖高脂飼料（斯貝福生物科技有限公司）；鏈脲霉素（STZ，Sigma）；血糖試紙（羅氏公司）；肌酐試劑盒、尿素氮試劑盒、尿蛋白試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增試劑盒（天根生物科技有限公司）；兔抗鼠VEGF（貨號：ab1316）和 TGF-β1（貨號：ab15715）一抗，羊抗兔免疫組化二抗（貨號：ab6721，Abcam）；多功能讀板機(jī)（Thermo）；光學(xué)顯微鏡（Nikon ECLIPSE TS100）；熒光定量PCR儀（Bio-RADiQTM5）。

1.3 藥物 參芪地黃湯藥液制備：分別稱取人參6 g、黃芪15 g、熟地黃15 g、山藥15 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g、山萸肉9 g、生姜3片、大棗10枚（中藥均購置于嘉興市中醫(yī)醫(yī)院中藥房），加入8倍量水浸泡2 h，煎煮2次，每次煎煮30 min，過濾藥渣，將得到的藥液濃縮至6 g生藥/mL，4 ℃冷藏備用。鹽酸貝納普利藥液制備：鹽酸貝納普利用去離子水配制成1.5 mg/mL的混懸液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模、給藥 將60只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥對照組和參芪地黃湯低、中、高劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組建立DN模型。采用高脂高糖飼料（配料為：67%正常飼料，20%蔗糖，10%豬油，2.5%膽固醇，0.5%膽酸鈉）喂養(yǎng)大鼠6周，誘導(dǎo)出現(xiàn)胰島素抵抗，腹腔注射枸櫞酸鈉溶解的STZ（劑量為35 mg/kg），注射后繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)12周[7]。注射STZ后，西藥對照組和參芪地黃湯低、中、高劑量組每日分別灌胃鹽酸貝納普利1 mg/kg和參芪地黃湯4.5、9、18 g生藥/kg，正常組和模型組每日灌胃等量生理鹽水，均每日1次，連續(xù)灌胃12周。各治療組處方量均按照《中藥藥理研究方法學(xué)》中，人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體表面積折算等效劑量比換算而來，其中中劑量組為人等效劑量。

2.2 指標(biāo)檢測

2.2.1 血糖 注射STZ后，各組大鼠每2周1次斷尾采血，檢測血糖水平，共12周。

2.2.2 腎功能生化指標(biāo) 干預(yù)12周后，每只大鼠分別置于代謝籠中24 h，留尿期間禁食，自由飲水，收集各組大鼠24 h尿液，計(jì)算24 h尿量。之后對大鼠進(jìn)行麻醉，主動(dòng)脈取血，收集血清，運(yùn)用試劑盒檢測各組大鼠血清中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）含量，記錄24 h尿蛋白水平。

2.2.3 腎組織病理表現(xiàn) 取大鼠左側(cè)腎臟，用福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化并拍照。

2.2.4 熒光定量PCR檢測腎組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達(dá) 取大鼠右側(cè)腎臟，用試劑盒提取腎組織中總RNA，使用UV法檢測每個(gè)樣品中的總RNA濃度。將純度合格的樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green Real Time RT-PCR試劑盒對cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR儀檢測各組大鼠腎組織中VEGF及TGF-β1 mRNA表達(dá)，采用β-actin為內(nèi)參，具體引物序列見表1。

表1 引物序列

2.2.5 免疫組化法檢測腎組織中VEGF、TGF-β1蛋白表達(dá) 一抗稀釋倍數(shù)：VEGF（1∶1000），TGF-β1（1∶2000）；二抗稀釋倍數(shù)：1∶4000。光學(xué)顯微鏡下對腎組織免疫組化結(jié)果進(jìn)行拍照，運(yùn)用Image J軟件對拍照后的圖片中VEGF及TGF-β1陽性表達(dá)區(qū)域進(jìn)行量化，計(jì)算出平均光密度[8]。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組大鼠檢測指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，正態(tài)分布判斷：小樣本采用Shapiro-Wilk（SW）檢驗(yàn)（P＞0.05為正態(tài)性），以及通過Q-Q圖方法判斷。計(jì)量資料符合正態(tài)分布且滿足方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組以上采用單因素方差分析，若方差齊則采用LSD事后比較（兩兩比較），若方差不齊，則采用Dunnett T3進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05判斷為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠血糖比較 造模開始后，與正常組比較，模型組和各給藥組大鼠血糖均顯著升高（P＜0.05）；藥物干預(yù)12周時(shí)，各給藥組大鼠血糖均明顯低于模型組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 注射STZ后各組大鼠血糖變化（±s，n=10）

3.2 各組大鼠腎功能生化指標(biāo)比較 干預(yù)12周時(shí)，造模大鼠血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平均顯著高于正常組（P＜0.05），各給藥組上述指標(biāo)明顯低于模型組（P＜0.05），各給藥組上述指標(biāo)水平組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 干預(yù)后各組大鼠腎功能相關(guān)生化指標(biāo)水平比較（±s）

表2 干預(yù)后各組大鼠腎功能相關(guān)生化指標(biāo)水平比較（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 肌酐/（μmol/L）尿素氮/（mmol/L）24 h尿蛋白/mg正常組 10 45.74±8.71 3.58±0.41 11.58±4.41模型組 10 128.82±12.34# 16.77±2.64# 27.50±9.61#西藥對照組 10 78.56±19.75#* 9.03±2.46#* 16.27±8.72#*參芪地黃湯低劑量組 10 102.52±25.41#*13.58±5.57#* 20.51±3.23#*參芪地黃湯中劑量組 10 96.49±20.05#*12.18±1.82#* 18.56±8.30#*參芪地黃湯高劑量組 10 81.59±18.46#*13.69±0.86#* 15.79±7.88#*

3.3 各組大鼠腎組織病理表現(xiàn)比較 模型組大鼠腎組織出現(xiàn)明顯的炎細(xì)胞浸潤及腎小球增生，腎小管明顯擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變并伴部分腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落；西藥對照組、參芪地黃湯中、高劑量組大鼠腎組織中炎細(xì)胞浸潤、腎小球增生及腎小管上皮細(xì)胞壞死明顯減輕，參芪地黃湯低劑量組大鼠腎組織中炎細(xì)胞浸潤有所減輕，但仍伴有部分腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落。見圖2。

圖2 干預(yù)后各組大鼠腎組織病理表現(xiàn)（HE染色，×200）

3.4 各組大鼠腎組織VEGF及TGF-β1 mRNA表達(dá)比較 模型組大鼠腎組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達(dá)與正常組相比顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，西藥對照組和參芪地黃湯中、高劑量組大鼠腎組織中VEGF mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），各給藥組大鼠腎組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；各給藥組上述指標(biāo)組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 干預(yù)后各組大鼠腎組織VEGF及TGF-β1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 干預(yù)后各組大鼠腎組織VEGF及TGF-β1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 VEGF TGF-β1正常組 10 0.57±0.09 0.35±0.19模型組 10 1.00±0.05# 1.00±0.02#西藥對照組 10 0.66±0.07*0.80±0.06*參芪地黃湯低劑量組 10 1.12±0.27# 0.71±0.23*參芪地黃湯中劑量組 10 0.68±0.16*0.57±0.18*參芪地黃湯高劑量組 10 0.75±0.06*0.62±0.09*

3.5 各組大鼠腎組織VEGF及TGF-β1蛋白表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果表明，VEGF陽性表達(dá)區(qū)域主要位于腎小球上皮細(xì)胞與腎小球基底膜，TGF-β1陽性表達(dá)區(qū)域主要位于腎小管及腎小球間質(zhì)。與正常組比較，模型組大鼠腎組織中VEGF及TGF-β1陽性表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中VEGF陽性表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），西藥對照組和參芪地黃湯中、高劑量組大鼠腎組織中TGF-β1陽性表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；各給藥組上述指標(biāo)組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

圖3 干預(yù)后各組大鼠腎臟免疫組化染色（×200）

表4 干預(yù)后各組大鼠腎組織VEGF及TGF-β1免疫組化平均光密度值比較（±s）

表4 干預(yù)后各組大鼠腎組織VEGF及TGF-β1免疫組化平均光密度值比較（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 VEGF TGF-β1正常組 10 0.37±0.05 0.19±0.08模型組 10 1.13±0.16# 0.57±0.17#西藥對照組 10 0.63±0.14#* 0.33±0.02#*參芪地黃湯低劑量組 10 0.71±0.18#* 0.38±0.10#參芪地黃湯中劑量組 10 0.65±0.05#* 0.26±0.08*參芪地黃湯高劑量組 10 0.58±0.15#* 0.23±0.04*

4 討論

本研究結(jié)果表明，模型組大鼠血糖明顯升高，說明發(fā)生糖尿病，且血清肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白水平均較正常組顯著升高，提示腎功能出現(xiàn)損害，與DN患者臨床血清生化檢測結(jié)果相吻合；病理染色同樣在模型組中觀察到了明顯的腎小球細(xì)胞增生、炎細(xì)胞浸潤及部分腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落，這與DN的組織病理學(xué)變化相一致[1]。結(jié)合以上結(jié)果，提示DN模型建立成功。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明參芪地黃湯對DN大鼠具有一定的治療作用[9]。此外，參芪地黃湯聯(lián)合桃紅四物湯可顯著降低DN患者血糖，同時(shí)緩解DN患者腎功能生化指標(biāo)[10]。我們研究同樣表明給DN模型大鼠灌胃參芪地黃湯后，血糖降低，中劑量及高劑量可顯著改善DN模型大鼠腎功能相關(guān)生化指標(biāo)及腎組織形態(tài)，提示參芪地黃湯對DN具有明顯的療效。

腎臟中的VEGF和TGF-β1表達(dá)異常與DN密切相關(guān)，VEGF在腎小球足細(xì)胞、腎小管和集合管細(xì)胞中廣泛表達(dá)，腎組織中的VEGF參與維持腎小球?yàn)V過功能，此外也有研究表明VEGF可調(diào)控足細(xì)胞活性。糖尿病患者長期的高血糖可損害腎小球及腎小管細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞，從而使腎組織中VEGF表達(dá)異常，過度表達(dá)的VEGF可促使上皮細(xì)胞形成血管環(huán)，損傷腎小球的濾過功能。此外，VEGF的過度表達(dá)也是導(dǎo)致DN蛋白尿的重要原因之一[2]。本研究觀察到模型組大鼠腎組織有明顯的腎小球增生，同時(shí)模型組大鼠24 h尿蛋白顯著升高，提示腎小球?yàn)V過功能損傷。qPCR及免疫組化結(jié)果表明模型組大鼠腎組織中VEGF表達(dá)顯著上調(diào)，表明腎組織中VEGF的上調(diào)是引起DN模型大鼠腎小球?yàn)V過功能損害及腎小球增生的機(jī)制之一。此外，高血糖可促使腎組織中TGF-β1表達(dá)升高，進(jìn)而促使腎組織中細(xì)胞外基質(zhì)的黏附與過度沉積，可引起腎小球增生硬化及腎小管纖維化，同時(shí)也可加劇腎組織中炎癥反應(yīng)[3]。下調(diào)腎組織中TGF-β1表達(dá)可緩解DN[3，11]。本研究觀察到模型組大鼠腎組織出現(xiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤，同時(shí)伴有TGF-β1表達(dá)的升高，提示TGF-β1表達(dá)的上調(diào)可能是引起DN大鼠腎組織炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一。參芪地黃湯可顯著降低DN模型大鼠腎組織中VEGF、TGF-β1基因及蛋白水平，表明參芪地黃湯可通過降低DN模型大鼠腎組織中VEGF和TGF-β1表達(dá)，改善腎小球?yàn)V過率及腎組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮治療DN的作用。

綜上，參芪地黃湯對DN模型具有明顯的療效，且能明顯改善腎組織病理表現(xiàn)，推測其可能的作用機(jī)制與降低腎組織VEGF和TGF-β1表達(dá)有關(guān)。各給藥組的作用效果比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮與樣本量小或樣本誤差有關(guān)，并不能說明參芪地黃湯能替代鹽酸貝納普利，參芪地黃湯低劑量組對VEGF、TGF-β1基因及蛋白表達(dá)效果不一致亦可能為樣本誤差，均需進(jìn)一步研究。