龍眼核多酚對LPS 誘導(dǎo)的ALI 小鼠肺組織的保護(hù)作用及機制

范風(fēng)穎，駱 姍，趙 莉

急性肺損傷（ALI）是臨床常見的肺部疾病，以持續(xù)或急性肺部炎癥為病理基礎(chǔ)，因嗜中性粒細(xì)胞聚集，損傷肺泡-毛細(xì)血管屏障，導(dǎo)致出現(xiàn)肺間質(zhì)水腫、非心源性肺水腫等病理特征[1]。該病發(fā)生機制主要是因體內(nèi)炎性水平升高、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強導(dǎo)致，氧化應(yīng)激會增加體內(nèi)活性氧簇分泌量，引起氣道與血管重塑，并侵犯至肺間質(zhì)，導(dǎo)致肺水腫發(fā)生[2]。在實驗動物模型建立時，常采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)，LPS是革蘭陰性菌主要細(xì)胞壁成分，是人體感染革蘭陰性菌的重要病原菌，其誘導(dǎo)作用是誘導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)過度激活，促進(jìn)大量活性氧大量釋放，引起氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，故會導(dǎo)致肺損傷[3]。目前肺損傷缺乏特異性治療藥物，研究相關(guān)治療藥物是重癥科研究重點。龍眼也稱為桂圓，肉質(zhì)清脆、味美香甜，果肉內(nèi)含有豐富的碳水化合物、氨基酸、維生素C、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，并含有豐富的多酚、多糖、多肽、皂苷類活性成分，有雙重的營養(yǎng)與藥用成分。中醫(yī)認(rèn)為龍眼歸心、脾經(jīng)，有補氣養(yǎng)血、安神定志、養(yǎng)心健脾功效。有研究[4]表明，除了龍眼肉，龍眼核有雙重的營養(yǎng)、保健功效，核內(nèi)含有的脂肪、生物堿等成分，經(jīng)多種分離純化技術(shù)并能從龍眼核內(nèi)提取到多酚成分，起到抗氧化、抗炎、降血糖等作用。但龍眼核多酚是否能夠作為治療ALI 的相關(guān)藥物，以及其肺組織保護(hù)機制缺乏研究報道?，F(xiàn)本研究就分析眼核多酚對ALI 小鼠的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性小鼠40 只（新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供），SPF 級，周齡6～8 w，體重18～22 g；飼養(yǎng)環(huán)境SPF 級，室溫20～25 ℃，濕度40%～60%，自由攝食、飲水。

1.2 藥物與試劑 龍眼核：高州產(chǎn)地；地塞米松片：廣東華南藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H44024469，0.75 mg/片；脂多糖：Sigma 公司；酶聯(lián)免疫法試劑盒購自羅氏公司；MR-96A 酶標(biāo)分析儀購自深圳邁瑞生物；1658001 蛋白印跡電泳儀購自美國BioRad 公司；TD5-Ⅱ型離心機購自長沙平凡；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺購自蘇州安泰。

1.3 龍眼核多酚提取 將龍眼核研磨成粉，精密稱量后，過60 目篩，備用。粉末200 g，加入95%乙醇1 L，70 ℃環(huán)境下，對龍眼核粉末進(jìn)行攪拌，提取3 次，每次作用3 h。合并提取液，離心15 min，3500 r/min，壓縮提取液至無醇味浸膏。添加蒸餾水后分散，石油醚脫脂，對其分別加入氯仿、乙酸乙酯等溶劑萃取，合并萃取液，再壓縮、回收，對不同濃縮物進(jìn)行干燥，液-液萃取法分離出龍眼核多酚。

1.4 動物模型建立 動物模型建立：小鼠得到1 w適應(yīng)性喂養(yǎng)，模型建立前連續(xù)灌胃3 d，對照組、模型組分別腹腔注射等量生理鹽水，地塞米松組：腹腔注射地塞米松20 mg/kg；龍眼核多酚組：腹腔注射龍眼核多酚20 mg/kg，連續(xù)3 d，末次給藥1 h 后于小鼠尾部靜脈注射LPS 0.5 ml，建立ALI 模型，其中對照組僅注射等量生理鹽水。

造模完成24 h 后，摘除小鼠眼球，留取血液標(biāo)本，對血液標(biāo)本離心15 min，3500 r/min，將血液標(biāo)本置于-20 ℃環(huán)境內(nèi)保存。將小鼠處死后，開胸取左肺組織，吸干血跡后，電子秤測量肺組織濕重，隨后將肺組織置入60 ℃烘箱內(nèi)，連續(xù)48 h 后測量干重，計算干濕重比值：濕重/干重。取肺組織，甲醛固定24 h，切片，HE 染色，用顯微鏡觀察肺組織病理特征，對肺泡水腫、肺泡充血、肺間質(zhì)水腫、肺泡壁增厚，分別計0～4 分：0 分：無改變；1 分：輕微變化；2分：中度變化；3 分：重度改變；4 分：極重度改變。小鼠處死后，分離器官，左肺用磷酸緩沖液沖洗，連續(xù)3 次，收集灌洗液，離心10 min，2000 r/min，收集上清液，磷酸緩沖液重懸，涂抹在載玻片，以Giemsa 染色，計算嗜中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞的數(shù)量，酶聯(lián)免疫吸附法檢測腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6及IL-1β。留取的分離血液標(biāo)本用WST-1 法檢測血清氧化應(yīng)激指標(biāo)：包括超氧化物歧化酶（SOD），測定肺組織內(nèi)丙二醛（MDA）。分離提取細(xì)胞總蛋白后，用增強化學(xué)發(fā)光法計算高遷移率族蛋白（HMG）B1、核因子（NF）-κB 表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件分析。計量數(shù)據(jù)用x±s 表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理特征 對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無滲出物，肺間質(zhì)正常，肺泡間隔無增厚；模型組肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡腔炎性浸潤，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增厚明顯，病理平均分為（12.51±3.48）分；地塞米松、龍眼核多酚組肺泡腔炎性減輕，肺間質(zhì)水腫緩解，肺泡間隔增厚不明顯，平均病理分分別為（4.81±1.63）、（5.02±0.65）分，地塞米松、龍眼核多酚組高于模型組（t=5.667，5.984；P=0.001,0.001）；而兩組比較無顯著差異（P>0.05）。

2.2 濕重/干重比值 對照組肺組織濕重/干重比值明顯低于其他3 組（P<0.05），而地塞米松、龍眼核多酚組較模型組下降（P<0.05），但地塞米松、龍眼核多酚組比較無顯著差異（P>0.05），見表1。

表1 4 組肺組織濕重/干重比值

注：與對照組比較,①P <0.05;與模型組比較,②P <0.05

2.3 炎性水平 對照組嗜中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞計數(shù)、TNF-α、IL-6 及IL-1β 均低于其他3 組（P<0.05），而地塞米松、龍眼核多酚組較模型組下降（P<0.05），但地塞米松、龍眼核多酚組比較無顯著差異（P>0.05），見表2。

表2 4 組炎性水平比較

2.4 氧化應(yīng)激反應(yīng) 對照組SOD 表達(dá)高于其他3 組，MDA 表達(dá)低于其他3 組（P<0.05），而地塞米松、龍眼核多酚組SOD 表達(dá)高于模型組，MDA 表達(dá)低于模型組（P<0.05），但地塞米松、龍眼核多酚組比較無顯著差異（P>0.05），見表3。

表3 四組氧化應(yīng)激反應(yīng)比較

2.5 HMGB1、NF-κB 表 達(dá) 模 型 組HMGB1、NFκB 表達(dá)較對照組升高（P<0.05），而地塞米松、龍眼核多酚組表達(dá)有所下降，較模型組低（P<0.05），見表4。

表4 不同H MGB1、N-?B 表達(dá)比較

表4 不同H MGB1、N-?B 表達(dá)比較

注：與對照組比較，①P <0.05;與模型組比較，②P <0.05

3 討論

ALI 發(fā)病機制復(fù)雜、進(jìn)展迅猛，其中革蘭陰性菌感染是其主要致病因素，誘發(fā)肺部炎性細(xì)胞浸潤及氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致肺間質(zhì)水腫、肺泡腔滲出[5-6]。脂多糖存在革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜，在注射脂多糖后會建立ALI 模型，為動物實驗展開奠定基礎(chǔ)[7-8]。本組研究，在用脂多糖誘導(dǎo)肺組織損傷小鼠模型，經(jīng)初死解剖肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡腔炎性浸潤，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增厚明顯。故采用脂多糖誘導(dǎo)，能成功建立ALI 小鼠模型。本組研究，3 組小鼠的肺組織病理評分、肺組織濕重/干重比值均高于對照組，其中模型組增加明顯，地塞米松、龍眼核多酚有所下降（P<0.05）。結(jié)果證實采用地塞米松與龍眼核多酚能減輕小鼠肺組織病理損傷，緩解肺泡間質(zhì)水腫，故肯定龍眼核多酚對肺組織有一定的保護(hù)作用。

ALI 是因炎癥細(xì)胞浸潤所致，外界環(huán)境改變，或促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞活性，白細(xì)胞計數(shù)升高，產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)，損傷肺組織上皮細(xì)胞[9-10]。本組研究，ALI 小鼠建立成功后，嗜中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞計數(shù)、TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平均明顯升高，且高于對照組，但在采用地塞米松、龍眼核多酚后其表達(dá)均明顯下降（P<0.05）。結(jié)果表明龍眼核多酚能夠下降小鼠炎癥反應(yīng)。龍眼核含有的生物堿、多酚等成分，具備理化除濕、止血鎮(zhèn)痛作用，且在現(xiàn)代藥理[11]研究中，通過提取龍眼核相關(guān)物質(zhì)，對多種病原菌起到不同程度的抑制作用，而多酚成分占龍眼核主要部分，故能肯定該物質(zhì)的作用。氧自由基增強過度是致ALI 的重要原因，而且炎癥細(xì)胞通過浸潤肺組織，會促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)[12-13]。SOD 是內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的重要因子，MDA 是體內(nèi)自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)后形成的產(chǎn)物，兩者表達(dá)直接反映了肺組織損傷程度[14]。本組研究對照組SOD 表達(dá)高于其他3 組，MDA 表達(dá)低于其他3 組（P<0.05），而地塞米松、龍眼核多酚組SOD 表達(dá)高于模型組，MDA 表達(dá)低于模型組（P<0.05），但地塞米松、龍眼核多酚組比較（P>0.05）。結(jié)果證實在建立動物模型后，氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯，而在用藥后可改善模型氧化損傷，以此能緩解肺組織炎性浸潤，降低炎癥水平。孫菡崢等[15]報道指出于龍眼核內(nèi)提取多酚含量為53.68 mg/g，抗氧化性能高，對氧自由基的清除率(73.90±0.60)%。楊敦杰等[16]報道龍眼核內(nèi)含有豐富的多酚類物質(zhì)，50%乙醇萃取物之總多酚化合物含量最高，且清除超氧陰離子能力最高。本組研究，地塞米松、龍眼核多酚組HMGB1、NF-κB 表 達(dá) 均 低 于 模 型 組（P<0.05）。HMGB1 是反映肺損傷的重要因子，其表達(dá)可激活Toll 樣受體4/NF-κB 通路，導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生[17-18]。研究提示龍眼核多酚通過下降HMGB1、NF-κB 表達(dá)，而起到保護(hù)肺組織的作用。

基于此，本研究認(rèn)為龍眼核多酚通過抑制小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低肺組織炎癥反應(yīng)，起到肺組織保護(hù)作用，緩解肺損傷程度。雖然其作用與地塞米松的作用效果無明顯差異，但在長期臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，地塞米松不良反應(yīng)多，會誘發(fā)呼吸困難、過敏性休克、低鉀血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，此時為龍眼核多酚的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[19-20]。

綜上所述，龍眼核多酚通過減輕因LPS 誘導(dǎo)的ALI 小鼠的炎癥反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到肺組織保護(hù)作用，緩解肺損傷程度。