DNA分子標記技術(shù)在菠菜遺傳育種中的應用研究進展

彭楓　張瑩　陳珂　戴雨柔　李亞兵　蔡曉鋒

摘? 要： 簡述了DNA分子標記的種類和特點，綜述了分子標記技術(shù)在菠菜遺傳育種中的主要應用，包括：性別鑒定、抗病菠菜育種、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菠菜培育、物種親緣關系和遺傳多樣性研究，及分子標記輔助育種等方面的研究進展，并對分子標記技術(shù)的發(fā)展和應用前景進行了展望.

關鍵詞： 分子標記; 菠菜; 遺傳育種

中圖分類號： S 636.1??? 文獻標志碼： A??? 文章編號： 1000-5137（2021）02-0237-06

Research progress of DNA molecular markers in spinach genetic breeding

PENG Feng¹， ZHANG Ying²， CHEN Ke¹， DAI Yurou¹， LI Yabing¹， CAI Xiaofeng^1*

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China;2.Department of Plant Science and Technology， Shanghai Vocational College ofAgriculture and Forestry， Shanghai 201699， China）

Abstract： The types and characteristics of DNA molecular markers were briefly introduced in this paper，while itemphatically illustrated sex test，disease-resistant spinach breeding，high-yield and high-quality spinach breeding，genetic relationship and diversity and molecular marker-assisted selection in spinach genetic breeding.Then，the future development and application prospects of DNA molecular markers were prospected.

Key words： molecular marker; spinach; genetic breeding

菠菜（Spinacia oleracea L.）為莧科藜亞科菠菜屬植物^[1]，是以綠葉為主要產(chǎn)品器官的1～2年生草本植物.由于其具有適應性較強、適應性廣、易儲存、供應期長、栽培方式多樣等優(yōu)點，可實現(xiàn)周年供應，是一種重要的經(jīng)濟蔬菜作物.菠菜可鮮食亦可加工，是中國分布最普遍、群眾食用最廣泛的蔬菜之一，同時也是中國出口創(chuàng)匯的主要蔬菜之一^[2].菠菜在中國的種植面積僅次于大白菜、青花菜、甘藍等蔬菜作物，位居第4^[3].

在常規(guī)育種工作中，研究人員基于植株的表型性狀對特定植物進行定向選擇，但選擇效率低、耗時費力.為加速植物的育種改良進程，分子標記應運而生.分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)DNA的多態(tài)性為基礎的遺傳標記，它相對于其他的遺傳標記具有準確性高、信息量大、檢測手段簡單迅速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點^[4].近年來，隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，分子標記技術(shù)也在不斷完善進步.隨著分子標記技術(shù)的不斷成熟，其在園藝作物育種中的應用范圍也越來越廣泛.

本文在簡述DNA分子標記的種類和特點的基礎上，重點闡述了分子標記技術(shù)在菠菜抗病性研究、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菠菜培育、品種鑒定和性別鑒定、物種親緣關系和遺傳多樣性研究，以及分子標記輔助育種等方面的研究現(xiàn)狀，并對分子標記技術(shù)的發(fā)展和應用前景進行了展望.

1? DNA分子標記的種類和特點

DNA分子標記技術(shù)興起于20世紀80年代，隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，到21世紀初，已經(jīng)成為應用十分廣泛而且比較成熟的技術(shù).根據(jù)DNA檢測方法的不同，可以將DNA標記分為4類：1） 基于分子雜交的分子標記技術(shù)，主要有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）和數(shù)目可變串聯(lián)重復多態(tài)性（VNTR）;2） 以PCR為基礎的分子標記技術(shù)，包括隨機引物PCR和特異引物PCR，主要有隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、序列標簽位點（STS）、簡單序列重復（SSR）、序列特征化擴增區(qū)域（SCAR）、單引物擴增反應（SPAR）、DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、抗病基因同源序列法（RGAP）;3） 限制性內(nèi)切酶和PCR相結(jié)合的技術(shù)，主要有擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）和酶切擴增多態(tài)性序列（CAPS）;4） 以單個核苷酸變異為核心的標記，主要有單核苷酸多態(tài)性（SNP）標記.不同的DNA分子標記技術(shù)各有其特點和適用領域，明確常見DNA分子標記的特點，有利于選用合適的分子標記方法進行實驗研究^[5].

DNA分子標記具有許多優(yōu)點：一是可以利用植物各個發(fā)育時期的個體組織以及器官做材料進行檢測，不受環(huán)境條件的限制;二是檢測數(shù)量多，可以覆蓋整個基因組;三是標記比較穩(wěn)定、多態(tài)性高，這些優(yōu)點使得DNA分子標記技術(shù)能夠得到廣泛的應用^[6].目前在菠菜遺傳育種研究中應用較廣泛的有RAPD，AFLP，RFLP，SSR和SNP等.

2? 分子標記在菠菜遺傳育種中的應用

2.1 近緣種屬間遺傳進化關系和品種間遺傳多樣性

分子標記技術(shù)已廣泛地應用于物種系統(tǒng)演化及種間親緣關系分析，這類研究有助于弄清一些物種種屬的分類地位和起源，同時也有利于指導育種工作^[7].

吳婭妮等^[8]利用AFLP標記技術(shù)對110份來源不同的菠菜種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為0.64～0.87，與地理來源有很高的一致性，全部供試種質(zhì)可分為2類：歐美、西亞、東亞及中國北方種質(zhì)聚為一類，部分日本種質(zhì)和中國的南方種質(zhì)聚為另一類.梅燚等^[9]利用形態(tài)學分類法和AFLP分子標記技術(shù)對45份菠菜育種材料的遺傳多樣性和親緣關系進行了研究，聚類分析結(jié)果表明：第一類群主要以歐美資源和有歐美血統(tǒng)的雜交種為主，第二類群主要以日本資源和含有日本血統(tǒng)的雜交種為主，第三類群以中國本土品種為主.聚類結(jié)果與形態(tài)學的分類結(jié)果基本一致，而且聚類結(jié)果與地域來源和形態(tài)特征有一定的對應關系.AFLP標記能很好地從分子水平揭示菠菜資源的親緣關系.由親緣關系推測中國的南、北方菠菜種質(zhì)可能有著不同的起源.除此之外，SNP分子標記也廣泛應用于菠菜分類中.SHI等^[10]利用SNP標記將343份來源于世界各地的菠菜種質(zhì)資源分為2類，即亞洲種質(zhì)類群和歐美種質(zhì)類群.XU等^[11]利用SNP標記將120份菠菜種質(zhì)資源分為2類，即東亞、中國種質(zhì)類群和西亞、歐美及非洲種質(zhì)類群.

近年來，SSR標記越來越多地被用于菠菜遺傳多樣性研究和品種鑒定中.趙瑞麗等^[12]利用聚丙烯凝膠（PAGE）電泳法對33份菠菜種質(zhì)資源進行了指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析，篩選出的27對多態(tài)性明顯、帶型穩(wěn)定的引物，共擴增出109個多態(tài)性位點，平均每對引物約4個.經(jīng)多態(tài)性位點分析，用7對高多態(tài)性引物構(gòu)建了能夠區(qū)分33份菠菜種質(zhì)的指紋圖譜，為供試材料的鑒別提供參考.G?L等^[13]將85個篩選出來的標記應用于來自世界各地的48個菠菜種質(zhì)，產(chǎn)生389個等位基因，其中89%具有多態(tài)性，結(jié)果表明：新開發(fā)的SSR標記適合評估菠菜種質(zhì)的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu).這些標記還揭示了基于地理起源的種質(zhì)聚類，遠東種質(zhì)分離明顯，與來自波斯、土耳其、歐洲和美國的種質(zhì)相比，總體上遺傳多樣性最豐富.LI等^[14]用41對SSR引物對收集自中國的43個菠菜品種進行了遺傳多樣性研究，結(jié)果表明：41個標記的平均多態(tài)性信息含量值為0.43，代表中等水平，菠菜品種遺傳多樣性較低.

2.2 高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菠菜育種

產(chǎn)量和品質(zhì)是菠菜品種選育的重要指標.菠菜的產(chǎn)量構(gòu)成因素主要有株型、單株葉數(shù)、葉片大小、單株質(zhì)量等;菠菜的品質(zhì)包括外觀品質(zhì)，例如葉色、葉面光澤度等，以及內(nèi)在品質(zhì)，例如草酸、硝酸鹽及維生素C含量等^[15].菠菜育種過程中應選擇外觀品質(zhì)好、內(nèi)在品質(zhì)優(yōu)的品系或品種.除此之外，耐抽薹也是菠菜的重要育種目標.菠菜是典型的長日照蔬菜，在長日照（日照時間大于13 h）條件下，即使不經(jīng)受低溫，也可分化花芽并抽薹開花.在春茬、夏茬和早秋菠菜栽培過程中，如果栽培的品種不耐抽薹，經(jīng)常會出現(xiàn)早期抽薹現(xiàn)象，造成巨大的生產(chǎn)損失.通過分子標記輔助選擇有利于高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菠菜育種.

MA等^[16]對323種來自美國農(nóng)業(yè)部（USDA）的菠菜種質(zhì)資源的3個葉片性狀（平滑度、葉柄色和葉緣形狀）進行了關聯(lián)性分析，通過基因分型技術(shù)（GBS）進行SNP鑒定，發(fā)現(xiàn)5個SNPs與葉片平滑度有關，7個SNPs與葉緣形狀有關，14個SNPs與葉柄顏色有關，這些SNP標記有助于葉片性狀的篩選.CHITWOOD等^[17]運用GBS篩選的SNPs對288種來自USDA的種質(zhì)資源進行了基因分型，確定了3個SNP標記（AYZV02001321_398，AYZV02041012_1060，AYZV02118171_95）與抽薹性相關;8個SNP標記（AYZV02014270_540，AYZV02250508_2162，AYZV02091523_19842，AYZV02141794_376，AYZV02077023_64，AYZV02210662_2532，AYZV02153224_2197，AYZV02003975_248）與株高相關;4個SNP標記（AYZV02188832_229，AYZV02219088_79，AYZV02030116_256，AYZV02129827_197）與菠菜直立性相關.

礦物質(zhì)元素濃度的單核苷酸多態(tài)性標記對于支持菠菜分子育種是非常重要的.QIN等^[18]對菠菜進行全基因組關聯(lián)研究（GWAS），并在USDA-GRIN菠菜種質(zhì)資源中鑒定了與礦物質(zhì)元素相關的SNP標記.鑒定出45個SNP標記為與13種礦物質(zhì)元素（B，Ca，Co，Cu，F(xiàn)e，Mg，Mn，Mo，Na，Ni，P，S，Zn）的濃度密切相關;兩個SNP標記與K濃度弱相關.SHI等^[19]對310種菠菜基因型進行了草酸濃度相關性分析，并鑒定與之相關的SNP標記，結(jié)果表明：草酸含量是由多個因素控制的數(shù)量性狀基因，每個基因在被測菠菜中均具有較小的作用.關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)6個SNP標記（AYZV02031464_116，AYZV02031464_117，AYZV02031464_95，AYZV02283363_2707，AYZV02287123_2830，AYZV02296293_852）與草酸濃度相關.這些SNP分子標記的確定有助于標記輔助選擇培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的菠菜品種^[17].

2.3 抗病育種

菠菜在中國可以實現(xiàn)周年栽培^[20]，但在長期、固定栽培生產(chǎn)環(huán)境中，菠菜病害也愈加嚴重，將分子標記運用于菠菜抗病研究中，有利于培育抗病菠菜.

中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所^[21]利用其構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合關聯(lián)分析技術(shù)，將菠菜霜霉病抗性位點RPF1定位到菠菜3號染色體的1.72 Mb區(qū)域內(nèi)，進一步通過SLAF-Seq開發(fā)的分子標記將RPF1定位到0.89 Mb區(qū)域內(nèi).該區(qū)域包含14個R基因，并鑒定出3個抗菠菜1～7，9，11，13和15號霜霉病生理小種的候選基因（Spo12729，Spo12784和Spo12903），根據(jù)這3個基因在感病和抗病菠菜材料之間的差異位點，開發(fā)了3個分子標記，為后期進行菠菜霜霉病分子標記抗性鑒定提供保障.SHI等^[22]通過對273種菠菜基因型進行葉斑病抗性分析，結(jié)合關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)8個SNP標記（AYZV02052595_115，AYZV02052595_122，AYZV02057770_10404，AYZV02129827_205，AYZV0-2152692_182，AYZV02180153_337，AYZV02225889_197，AYZV02258563_213）與葉斑病抗性有很強的相關性.SHI等^[23]還利用相同的方法，鑒定出5個SNP標記（AYZV02052595_108，AYZV02112284_14543，AYZV02123399_146，AYZV02164612_331，AYZV02170942_274）與黃萎病抗性相關，這些SNP標記將成為菠菜分子育種中，通過標記輔助選擇抗葉斑病和黃萎病的工具.

2.4 性別鑒定

菠菜系雌雄異株植物，開花前無法判定性別.由于菠菜性別不同，經(jīng)濟價值不同（雄株葉片肥大、長勢好、上市早，比雌株高產(chǎn)），對其性別的早期鑒定尤顯重要^[24].利用分子標記技術(shù)探討菠菜不同性別植株基因組之間的差異，篩選與性別相關的分子標記，不僅為菠菜性別的早期鑒定提供技術(shù)手段，且為研究雌雄異株植物的性別決定和分化機制、克隆與性別相關的基因提供了參考.

楊金華等^[25]利用ISSR擴增體系在雌、雄DNA混池中篩選出一個能擴增出約1 200 bp的雌性連鎖標記I62，并將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性和特異性更好的SCAR標記，該標記在雌株中可以擴增出1 176 bp的特異條帶，而在雄株中沒有其條帶.鄧傳良等^[26]設計了7對EST-SSR引物，在適合的PCR反應體系下，分別以雌、雄菠菜DNA基因組為模板，對設計的EST-SSR引物進行篩選，結(jié)果顯示：以EST序列HS097148設計的一對引物從菠菜雌雄基因組中擴增出一條雄性特異的條帶，表明通過菠菜EST-SSR引物獲得菠菜性別相關特異序列是可行的.劉丹丹等^[27]采用SRAP-BSA法篩選到3個與性別基因X/Y緊密連鎖的SRAP標記：SRAP4.3，SRAP5.7和SRAP9.5，并將SRAP5.7和SRAP9.5轉(zhuǎn)化為SCAR標記（S5.7，S9.5），將SRAP4.3轉(zhuǎn)化為dCAPs標記（D4.3）.其中SCARP標記S5.7，S9.5與Y基因共分離，dCAPs標記D4.3與X/Y基因緊密連鎖，遺傳距離為0.3 cm.分子標記S5.7和S9.5在菠菜雄株里可以分別擴出126 bp和119 bp的特異性條帶，在雌株里沒有條帶.dCAPs標記D4.3在雌、雄株中都可以擴出179 bp的條帶.用AluI內(nèi)切酶酶切，雌株只有1條帶，而雄株有2條帶，分子標記鑒定結(jié)果與表型鑒定結(jié)果一致，說明這3個分子標記可以用于分子標記輔助選擇育種.

3? 展望

分子標記技術(shù)雖然僅發(fā)展了20余年，但已滲透于整個生物研究界.在農(nóng)業(yè)研究中，它作為一種重要的育種手段已充分顯示出獨特的優(yōu)越性，目前分子標記輔助育種技術(shù)已在蔬菜遺傳育種中廣泛應用.由于菠菜的重要性不及糧食作物，分子標記技術(shù)在菠菜上的應用較少，分子標記技術(shù)在菠菜研究中的應用具有廣闊的前景.另一方面，分子標記技術(shù)仍然為一種新的技術(shù)，應與傳統(tǒng)的育種技術(shù)有機結(jié)合.分子標記技術(shù)的檢測結(jié)果和效應最終要到大田試驗中驗證.隨著分子生物學的發(fā)展，將分子標記育種技術(shù)與傳統(tǒng)育種很好地結(jié)合起來，必將對菠菜的遺傳育種起著巨大的推動作用.

隨著菠菜基因組的測序完成，利用全基因組關聯(lián)分析，結(jié)合傳統(tǒng)遺傳定位將篩選獲得更多與耐熱、性別調(diào)控、抗霜霉病等性狀有關的分子標記，為分子標記輔助選擇育種奠定堅實的基礎，也為挖掘菠菜分子遺傳信息和機制提供重要契機，將大大促進菠菜基礎研究和應用研究的進展.因此，進一步加快菠菜分子標記的開發(fā)，篩選與菠菜性型、抗病及其他性狀緊密連鎖的分子標記，進行分子標記輔助選擇育種、多位點聚合育種及分子設計育種，也是未來菠菜育種的發(fā)展方向^[28].

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（責任編輯：顧浩然，包震宇）