超聲波輔助溶劑法提取沙棘果油工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

林可，王斌*，張丹丹，葛正凱，薛丕衛(wèi),2

(1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆伊犁金康蘇沙棘產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，新疆 伊犁 835000)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)，屬胡頹子科(Elaeagnaceae)落葉灌木或小喬木，又名醋柳、黑刺、酸刺，主要在東經(jīng)2°～123°，北緯 27°～69°之間亞歐大陸的溫帶地區(qū)[1]。沙棘耐寒，耐旱，耐風(fēng)沙，耐土壤貧瘠，適合在我國西北、華北、東北、西南等地區(qū)種植。中國是沙棘的發(fā)源地，沙棘的種植面積和產(chǎn)量占世界總量的90%以上。而新疆作為中國沙棘的故鄉(xiāng)，其沙棘總產(chǎn)量達(dá)到全國的50%以上。沙棘的根、莖、葉、花、果實(shí)都含有生理活性物質(zhì)，其中，沙棘果實(shí)中的天然活性成分含量最高，具有良好的藥用和保健價(jià)值[2-3]。作為沙棘果實(shí)中最有價(jià)值的組分之一，沙棘油富含維生素、胡蘿卜素、黃酮類化合物、脂肪酸、葉酸、8種必需氨基酸和多種微量元素等，對燒傷、潰瘍等疾病有特殊療效，同時(shí)還具有抗輻射、抗衰老、調(diào)節(jié)人體免疫力、緩解動(dòng)脈粥樣硬化等功效，使其在醫(yī)藥、保健食品、美容化妝品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值[4]。

當(dāng)前，常用的提取沙棘果油油脂的方法主要有超臨界CO2萃取法、有機(jī)溶劑萃取法、水代法、水酶法、超聲波輔助法和微波輔助法等[5-6]。有機(jī)溶劑萃取根據(jù)相似相溶原理，選擇與物料極性相近的有機(jī)溶劑最大程度地分離油脂，在工業(yè)生產(chǎn)中是一種相對簡單的油脂提取方法。超聲波的作用主要是空化效應(yīng)，在超聲波作用下，空化泡能瞬間漲大并破裂，產(chǎn)生高達(dá)幾千個(gè)大氣壓瞬時(shí)壓力，同時(shí)伴有強(qiáng)大沖擊波和微聲流，從而將細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)油脂得以釋放，提高出油率[7-9]。近年來，超聲波輔助與有機(jī)溶劑相結(jié)合的提取技術(shù)因具有提取時(shí)間短、效率高、可提高油脂品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取[10]。研究表明，超聲波的使用能夠促進(jìn)有機(jī)溶劑提取油脂的效果進(jìn)一步提高。

新疆沙棘資源豐富，沙棘果具有極高的生物活性。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取新疆沙棘果油，并探討了提取沙棘果油的抗氧化效果，為新疆地區(qū)沙棘果油的提取與應(yīng)用提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用的沙棘原漿來源于新疆伊犁金康蘇沙棘產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，用車載冰箱運(yùn)輸，于-20 ℃保藏；石油醚(60～90 ℃)、正己烷、乙酸乙酯：均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、DPPH溶液、ABTS溶液、過硫酸鉀、結(jié)晶紫、硫酸亞鐵、磷酸、檸檬酸、過氧化氫、VC：均為分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ250-DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；日本YAMATO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 重慶雅馬拓科技有限公司；津騰溶劑過濾器 天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；756PC紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沙棘果油提取工藝流程

沙棘果實(shí)→擠壓破碎→分離沙棘籽→沙棘原漿→加有機(jī)溶劑→超聲輔助提取(多次)→靜置分離→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑→燒瓶冷卻至室溫稱重→差量法獲得沙棘果油質(zhì)量。每組試驗(yàn)平行3次，采用最小顯著差異的方法對單因素試驗(yàn)進(jìn)行方差分析。

1.3.2 提取率的計(jì)算

式中：R是沙棘果油的提取率，%；M1是沙棘果油和蒸餾燒瓶的質(zhì)量，g；M2是蒸餾燒瓶的質(zhì)量，g；M是沙棘原漿的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

稱量沙棘原漿10.00 g，在超聲波功率為200 W、超聲頻率為45 kHz的條件下，按照上述試驗(yàn)步驟，以料液比為1∶6 (g/mL)在樣品中分別加入有機(jī)溶劑石油醚、正己烷和乙酸乙酯，提取時(shí)間設(shè)定為20 min，以沙棘果油的提取率確定最佳的提取溶劑。

最佳提取溶劑確定后，以提取溫度40，45，50，55，60 ℃，提取時(shí)間15，20，25，30，35 min，料液比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 (g/mL)，提取次數(shù)1，2，3，4次，采用單因素試驗(yàn)研究這4個(gè)因素對沙棘果油提取率的影響，每組試驗(yàn)平行3次。

1.3.4 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.3.5 沙棘果油抗氧化活性的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

參考史亞男等[11]的方法，用無水乙醇分別配制不同濃度的沙棘果油待測溶液(2，4，8，16，20 mg/mL)，準(zhǔn)確吸取待測溶液2.0 mL，加入2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混合均勻，在黑暗條件下靜置30 min。以無水乙醇調(diào)零，并用紫外分光光度計(jì)測定其在波長為517 nm處的吸光值A(chǔ)樣品；測定樣品溶液2.0 mL與無水乙醇2.0 mL混合液的吸光值A(chǔ)對照；最后測定2.0 mL DPPH溶液和2.0 mL無水乙醇的吸光值A(chǔ)空白。每組試驗(yàn)測定3次，并以平均值繪圖。以VC為陽性對照，使用前以蒸餾水配制質(zhì)量濃度與沙棘果油相同的對照液。用蒸餾水為空白對照，每個(gè)濃度測定3次，計(jì)算公式如下：

1.3.5.2 ABTS自由基清除能力

參考崔同等[12]的方法，在室溫下，先以5 mL ABTS溶液(7 mmol/L)與88 μL的K2S2O3溶液(140 mmol/L)充分混合，在黑暗條件下靜置過夜，得到ABTS儲備液。之后用無水乙醇稀釋，并在波長為734 nm下測定，使稀釋后的儲備液的吸光度為0.70±0.02。用無水乙醇配制不同濃度的沙棘果油待測溶液(2，4，8，16，20 mg/mL)，取不同的待測溶液100 μL，并加入0.9 mL的ABTS稀釋液，使其反應(yīng)1 min，測定吸光度為A樣品；測定稀釋后的ABTS溶液的吸光度為A對照。每個(gè)濃度測定3次，并以平均值繪圖。將VC作為陽性對照，使用前以蒸餾水配制質(zhì)量濃度與沙棘果油溶液相同的對照液。用蒸餾水做空白對照，每個(gè)濃度測定3次。上述的檢測波長均為734 nm，計(jì)算公式如下：

1.3.5.3 羥自由基清除能力

參考高燕[13]的方法，用無水乙醇分別配制不同濃度的沙棘果油待測溶液(2，4，8，16，20 mg/mL)，在25 mL的具塞比色管中分別加入0.3 mL結(jié)晶紫溶液(0.4 mmol/L)、0.6 mL H2O2溶液(2.0 mmol/L)和1.2 mL FeSO4(1.0 mmol/L)溶液。將上述溶液用磷酸-檸檬酸緩沖溶液(pH 4.0)定容至10 mL，充分振蕩搖勻后靜置30 min，測其吸光度Ab，同時(shí)測定不加H2O2的吸光度A0，測定波長為580 nm。在加H2O2之前分別在上述體系中加入不同濃度的待測液2 mL，測定其吸光度為As。每個(gè)濃度測定3次，并以平均值繪圖。以VC作為陽性對照，使用前用蒸餾水配制質(zhì)量濃度與沙棘果油溶液相同的對照液。用蒸餾水做空白對照，每個(gè)濃度測定3次，計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 有機(jī)溶劑對沙棘果油提取率的影響

根據(jù)“相似相溶”原理，正己烷、石油醚、乙酸乙酯和乙醇等有機(jī)溶劑被廣泛用于提取植物油脂。本研究以沙棘果油提取率為指標(biāo)，依據(jù)溶劑的介電常數(shù)和脫溶難易程度考察了3種常用的有機(jī)溶劑即正己烷、石油醚、乙酸乙酯對沙棘果油提取率的影響。本研究在沙棘原漿10.00 g、超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、超聲溫度45 ℃、超聲處理時(shí)間20 min、料液比1∶6 (g/mL)、提取次數(shù)為1次的條件下，考察了正己烷、石油醚、乙酸乙酯對沙棘果油提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 有機(jī)溶劑的影響Fig.1 The effect of organic solvents

由圖1可知，采用不同有機(jī)溶劑提取沙棘果油時(shí)，提取率存在顯著差異，其中石油醚的提取率最高，達(dá)到1.1%。正己烷的提取率為0.4%，提取效果最差。因此，本研究以石油醚為萃取溶劑用于后期沙棘果油的提取。

2.1.2 超聲處理時(shí)間對沙棘果油提取率的影響

超聲處理時(shí)間的增加可以使原料和溶劑充分接觸，從而加快油脂溶出，提高提取率。本研究在沙棘原漿10.00 g、超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、超聲溫度45 ℃、提取次數(shù)為1次的條件下，以石油醚為提取溶劑，料液比為1∶6時(shí)，考察了不同超聲處理時(shí)間15，20，25，30，35 min對沙棘果油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時(shí)間的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time

由圖2可知，由于原料中提取物的含量是一定的，隨著超聲時(shí)間的延長，超聲波對物料的作用更加充分，沙棘果油的提取率增大，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，提取率反而下降，可能是由于過長的超聲時(shí)間會引起熱效應(yīng)，導(dǎo)致有機(jī)溶劑揮發(fā)，并發(fā)生了油脂夾帶的現(xiàn)象[14]。結(jié)果表明，超聲處理時(shí)間為25 min時(shí)沙棘果油的提取率可達(dá)0.7%。因此，選取25 min作為最佳超聲處理時(shí)間。

2.1.3 超聲溫度對沙棘果油提取率的影響

分子動(dòng)能大小受溫度的影響，升溫可以加快分子運(yùn)動(dòng)速度，促進(jìn)分子擴(kuò)散。本研究在沙棘原漿10.00 g、超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、超聲時(shí)間25 min、提取次數(shù)為1次的條件下，以石油醚為提取溶劑，料液比為1∶6時(shí)，考察不同超聲溫度40，45，50，55，60 ℃對沙棘果油提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲溫度的影響Fig.3 The effect of ultrasonic temperature

由圖3可知，當(dāng)超聲溫度從40 ℃提高到50 ℃時(shí)，沙棘果油的提取率不斷增加。這是因?yàn)闇囟鹊纳呒涌炝擞袡C(jī)溶劑和油脂分子的運(yùn)動(dòng)速度，促進(jìn)了油脂的擴(kuò)散。但繼續(xù)增加超聲溫度，沙棘果油的提取率反而下降，這可能是由于溫度接近有機(jī)溶劑石油醚的沸點(diǎn)時(shí)，部分石油醚揮發(fā)，沙棘果油提取率下降，或者在石油醚揮發(fā)過程中夾帶了一些揮發(fā)性物質(zhì)。因此，選取50 ℃作為最佳超聲溫度。

2.1.4 料液比對沙棘果油提取率的影響

提取率受料液比的影響，料液比過低或過高都會造成提取率下降。在提取過程中，料液比過低不易溶出提取物，過高則會浪費(fèi)溶劑同時(shí)也會使提取物被稀釋。因此，為了提高提取率，選擇最佳的料液比至關(guān)重要。本研究在沙棘原漿10.00 g、超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、超聲時(shí)間25 min、超聲溫度50 ℃、提取次數(shù)為1次的條件下，以石油醚為提取溶劑，考察不同料液比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 (g/mL)對沙棘果油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 料液比的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio

由圖4可知，在料液比由1∶2增加到1∶6時(shí)，沙棘果油的提取率顯著提高，料液比為1∶6時(shí)提取率達(dá)到0.6%。繼續(xù)增加料液比，沙棘果油的提取率反而下降。這是由于石油醚用量增加，沙棘原漿與石油醚的濃度差增大，濃度差越大，沙棘果油越容易溶出，當(dāng)石油醚用量增加到一定值后，由于沙棘原漿中油脂含量逐漸減少，因此石油醚的增加不能使更多的油脂溶出，并且還會導(dǎo)致回收時(shí)間的延長，造成沙棘果油的浪費(fèi)。因此，選取1∶6作為最佳料液比。

2.1.5 提取次數(shù)對沙棘果油提取率的影響

隨著提取次數(shù)的增加，原料在溶劑中得到充分溶解。但次數(shù)過多不僅浪費(fèi)溶劑，而且提取時(shí)間也會相應(yīng)增長，從而導(dǎo)致提取成本增加。本研究在沙棘原漿10.00 g、超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、超聲時(shí)間25 min、超聲溫度50 ℃，以石油醚為提取溶劑，料液比為1∶6時(shí)，考察不同提取次數(shù)，1，2，3，4次對沙棘果油提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取次數(shù)的影響Fig.5 The effect of extraction times

由圖5可知，在超聲功率為200 W、超聲頻率為45 kHz、超聲處理時(shí)間為25 min、超聲溫度為50 ℃時(shí)，以料液比1∶6對沙棘原漿進(jìn)行多次提取，比較提取率，在對沙棘原漿提取2次時(shí)，提取率為0.9%，隨著提取次數(shù)的增加，提取3次和4次時(shí)提取率均為1.0%，僅比提取2次時(shí)提高了0.1%。這可能是因?yàn)樵谔崛?次時(shí)沙棘果油已基本溶出，再增加提取次數(shù)并不能溶出更多的沙棘果油。并且隨著提取次數(shù)的增多，濾液濃縮時(shí)間會增長，一定程度上給濃縮帶來困難。因此，選取2次作為最佳提取次數(shù)。

2.2 沙棘果油提取條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，由極差分析結(jié)果可以看出，各因素對沙棘果油提取率的影響有明顯差別，其影響順序?yàn)锽>D>C>A，即提取時(shí)間>提取次數(shù)>料液比>提取溫度。各主次因素最優(yōu)水平組成最優(yōu)提取工藝條件，為A3B2C1D2，即提取溫度55 ℃、提取時(shí)間25 min、料液比1∶4、提取次數(shù)2次為最優(yōu)提取工藝組合。

表2 沙棘果油提取L9(43)正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 2 The optimized results of orthogonal test L9(43)for extraction of sea buckthorn fruit oil

以石油醚為提取溶劑，在超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間25 min、料液比1∶4、提取次數(shù)2次的條件下對沙棘果油進(jìn)行提取，提取率達(dá)1.1%，優(yōu)于表2中每組提取結(jié)果，因此，A3B2C1D2為最佳提取工藝組合。

2.3 沙棘果油抗氧化活性測定

2.3.1 沙棘果油對DPPH自由基的清除能力

1,1-二苯基-2-苦基苯肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基和具有特征的紫紅色團(tuán)吸收峰，當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，與DPPH的單電子配對從而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與所接收的電子數(shù)呈定量關(guān)系，因此可用分光光度法進(jìn)行測定分析[15]。

圖6 沙棘果油和VC對DPPH的清除率Fig.6 The scavenging rates of sea buckthorn fruit oil and VC on DPPH free radical

由圖6可知，在選擇的沙棘果油溶液濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率與濃度呈正相關(guān)，在濃度范圍為0～10 mg/mL時(shí)，清除率隨著濃度增加而快速增加，在濃度范圍為10～20 mg/mL時(shí)，清除率增加相對緩慢且最終趨于平衡，最終的清除率達(dá)到96.5%，與VC清除DPPH自由基的清除率相近。而在同樣的濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率隨著VC濃度的增加無明顯變化，接近100%。在DPPH自由基清除試驗(yàn)中，VC的IC50值為0.98 mg/mL，而沙棘果油的IC50值為4.47 mg/mL，是VC的0.22倍，此時(shí)所需的沙棘原漿為406.36 mg。

2.3.2 沙棘果油對ABTS自由基的清除能力

ABTS法是根據(jù)對電子的轉(zhuǎn)移和對有色物質(zhì)的還原來測定抗氧化活性的。在ABTS自由基反應(yīng)中，抗氧化活性是以抗氧化劑抑制藍(lán)綠色的ABTS自由基的產(chǎn)生來評價(jià)的。

圖7 沙棘果油和VC對ABTS的清除率Fig.7 The scavenging rates of sea buckthorn fruit oil and VC on ABTS free radical

由圖7可知，在選擇的濃度范圍內(nèi)，ABTS自由基清除率與濃度呈良好的線性關(guān)系，在濃度范圍為2～20 mg/mL時(shí)，沙棘果油的ABTS自由基清除能力由9.50%增加到73.20%，而VC對ABTS自由基的清除能力在同樣的濃度范圍內(nèi)基本保持不變，維持在100%左右。在DPPH自由基清除試驗(yàn)中，VC的IC50值為0.98 mg/mL，而沙棘果油的IC50值為11.22 mg/mL，是VC的0.09倍，此時(shí)所需的沙棘原漿為1020 mg。

2.3.3 沙棘果油對羥自由基的清除能力

羥自由基是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的高細(xì)胞毒性自由基，它能引起胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的損傷，導(dǎo)致各種疾病和機(jī)體衰老現(xiàn)象，反應(yīng)速度很快。

圖8 沙棘果油和VC對·OH的清除率Fig.8 The scavenging rates of sea buckthorn fruit oil and VC on·OH free radical

由圖8可知，在選擇的濃度范圍內(nèi)，沙棘果油和VC對羥自由基的清除能力幾乎呈線性上升，顯現(xiàn)量效關(guān)系。在DPPH自由基清除試驗(yàn)中，VC的IC50值為10.12 mg/mL，而沙棘果油的IC50值為19.05 mg/mL，是VC的0.53倍，此時(shí)所需的沙棘原漿為1731 mg。

正常情況下，體內(nèi)活性氧化物處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，它的產(chǎn)生和消失有一定運(yùn)作機(jī)制。一但某些原因打破這種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，導(dǎo)致體內(nèi)氧化物增多或機(jī)體清除氧化物能力下降，機(jī)體就會產(chǎn)生應(yīng)激現(xiàn)象。當(dāng)機(jī)體不能及時(shí)有效地調(diào)節(jié)這種狀態(tài)時(shí)，活性氧化物的含量就會相對增加，對機(jī)體產(chǎn)生危害。為了機(jī)體免受細(xì)胞氧化物的損害，可以合理使用抗氧化劑和自由基清除劑保護(hù)機(jī)體。本文研究表明，沙棘果油能夠有效清除DPPH、ABTS以及羥自由基等活性氧化物，可以作為一種抗氧化劑。

3 結(jié)論

在本研究中，提取沙棘果油較為理想的有機(jī)溶劑為石油醚。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化沙棘果油的提取工藝，結(jié)果顯示：對提取率有影響的4個(gè)因素中，影響最大的為提取時(shí)間，最小的為提取溫度，其影響順序?yàn)樘崛r(shí)間>提取次數(shù)>料液比>提取溫度。正交試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果為提取溫度55 ℃、提取時(shí)間25 min、料液比1∶4、提取次數(shù)2次。體外抗氧化試驗(yàn)表明，沙棘果油對DPPH、ABTS和羥自由基的IC50值分別為4.47，11.22，19.05 mg/mL，分別是VC清除DPPH、ABTS和羥自由基的0.22，0.09，0.53倍，此時(shí)所需的沙棘原漿分別為406.36，1020，1731 mg。