分散液液微萃取/氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用快速測定醬油中糠醛類物質(zhì)

周斌，楊坤

(1.杭州市食品藥品檢驗研究院，杭州 310022；2.黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556012)

糠醛類物質(zhì)包括糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛，是一組重要的呋喃結(jié)構(gòu)化合物[1]，廣泛存在于各種食品中，例如面包、酒類、果醬、醋和醬油等[2-6]?？啡╊愇镔|(zhì)來源于食品加工中與糖相關(guān)的反應(yīng)，如美拉德反應(yīng)、酸性水解或焦糖化反應(yīng)等[7-8]。含糖食物在熱處理或長期儲存過程中，糠醛和5-羥甲基糠醛含量顯著增加，導致食物的顏色、質(zhì)地和風味發(fā)生變化[9]。因此，糠醛類物質(zhì)被認為是多種食物新鮮度和質(zhì)量的重要指標[10]。5-羥甲基糠醛還是一種能與人體蛋白結(jié)合產(chǎn)生的毒素，會刺激眼結(jié)膜，損害內(nèi)臟[11-12]。目前我國食品安全國家標準 GB 2760-2014《食品添加劑使用標準》中，糠醛、5-甲基糠醛允許作為食品香料使用。目前國內(nèi)外測定糠醛類物質(zhì)的方法主要有數(shù)字圖像比色法[13]、示差分光光度法[14]、固相微萃取氣相色譜法[15]、頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜法[16-18]、高效液相色譜法[19-21]和同位素稀釋液相色譜-質(zhì)譜法[22]。

分散液液微萃取技術(shù)是通過形成穩(wěn)定的萃取劑/分散劑/樣品溶液乳濁液體系，使待測物在樣品溶液及萃取劑之間快速達到分配平衡而完成萃取。因其方法簡單易行、環(huán)境污染少、成本低、靈敏度高等優(yōu)點，已應(yīng)用于環(huán)境分析、食品中有害物質(zhì)的分析[23]。本文將分散液液微萃取技術(shù)和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合測定醬油中糠醛類物質(zhì)含量，對樣品的前處理方法及GC-MS/MS分析條件進行優(yōu)化，通過對醬油中糠醛類物質(zhì)進行分析，驗證了該方法的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品：糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛(百靈威科技有限公司，純度≥98%)；氯苯、三氯甲烷、四氯乙烯、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷(色譜純，美國 Thermo Fisher Scientific公司)；實驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

CP450-300MS GC-MS/MS 美國Bruker公司；高速離心機 上海Heal Force公司；Milli-Q 裝置 美國Millipore公司；ME802型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

1.3.1.1 標準儲備液

將糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛用乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度為2000 mg/L的標準儲備液，于4 ℃冰箱中保存。

1.3.1.2 標準工作液

吸取合適的儲備液，用三氯甲烷逐級稀釋成0.002，0.01，0.05，0.2，0.5，1，5，10 mg/L的標準工作液。以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，離子峰面積(Y)為縱坐標，用外標法繪制標準工作曲線。

1.3.2 樣品前處理

稱取2 g試樣(精確至0.01 g)于20 mL刻度離心管中，加入10.0 mL乙腈，渦旋10 min。準確吸取1 mL乙腈提取溶液作為分散劑，于15 mL尖底塑料離心管中，加入5 mL水，渦旋混合后迅速加入100 μL三氯甲烷，渦旋3 min，6000 r/min離心5 min。用微量注射器抽取離心管底部的三氯甲烷，進行GC-MS/MS分析。

1.3.3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法

色譜柱：VF-WAXms(30 m×0.32 mm×1.0 μm)彈性石英毛細管柱；進樣口溫度230 ℃；柱升溫程序：初溫50 ℃保持0.5 min，以25 ℃/min的速率升溫至230 ℃保持6.5 min，共15 min；載氣：高純氦氣(99.999%)；柱流量1.0 mL/min；恒定流量模式；進樣量：1.0 μL。電子轟擊源(EI)；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；腔體溫度40 ℃；溶劑延時4.5 min；分段掃描；碰撞氣：氬氣，壓力為0.2 Pa(1.5 m Torr)。

3種物質(zhì)的母離子、子離子和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)參數(shù)見表1。

表1 3種物質(zhì)的定性及定量選擇離子和MRM參數(shù)Table 1 The qualitative and quantitative selection of ion and MRM parameters of the three furfurals

1.3.4 正交實驗

影響分散液液微萃取的因素有萃取劑體積、分散劑體積、水的體積、萃取時間等。本實驗通過對以上4個因素進行正交實驗，測定5-甲基糠醛的回收率的影響，確定最優(yōu)萃取條件。影響萃取效率的各因素水平見表2。

表2 萃取實驗各因素水平Table 2 The factors and levels of three furfurals＇ extraction test

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

3種糠醛類化合物均屬于極性化合物，應(yīng)采用極性低流失VF-WAXms色譜柱進行測定。分別進3種物質(zhì)標準溶液，通過全掃描(Scan)模式，確定化合物的結(jié)構(gòu)信息、保留時間。選擇峰強度最高的離子作為母離子，做進一步子離子掃描，分別選擇較高響應(yīng)和干擾少的子離子作為定量和定性離子，對各子離子碰撞能量進行優(yōu)化；3種糠醛類化合物的混合標準溶液總離子圖(TIC)見圖1，3種化合物峰形良好，響應(yīng)較高，無雜質(zhì)干擾。

圖1 3種糠醛類物質(zhì)標準品總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of standard samples of three furfurals

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

使用不同溶劑對3種糠醛類化合物的提取效率差別比較大?？啡╊愇镔|(zhì)屬于極性物質(zhì)，根據(jù)“相似相溶”原理，極性溶劑的提取效率較高。

由圖2可知，乙腈作為提取溶劑時，糠醛和5-甲基糠醛的回收率均大于85%，5-羥甲基糠醛的回收率為88.4%，明顯高于乙酸乙酯68.8%，二氯甲烷的66.7%和丙酮的66.2%。此外，乙腈作為提取溶劑時，不易提取油脂類物質(zhì)，可以減少雜質(zhì)干擾，故本次實驗采用乙腈作為提取溶劑。

圖2 使用不同提取溶劑時3種糠醛化合物的回收率Fig.2 The recovery rates of three furfurals under different extraction solvents

2.3 萃取溶劑的優(yōu)化

萃取劑需滿足以下要求：萃取劑與水較小溶解能力，密度必須大于水以便萃取溶劑沉淀至底部；對目標化合物的溶解性好；能滿足后續(xù)色譜分析。常用的萃取劑有二氯甲烷、氯苯、三氯甲烷、四氯乙烯等。

圖3 萃取劑種類對回收率的影響 Fig.3 The effect of different types of extraction solvents on the recovery rates

由圖3可知，由于二氯甲烷易揮發(fā)，萃取液體積變化大，實驗結(jié)果的重現(xiàn)性較差；三氯甲烷的萃取回收率(88.8%～97.8%)比氯苯(84.6%～93.1%)和四氯乙烯(77.9%～92.1%)要好，四氯化碳在水中的溶解度較小，可以減少萃取劑損失，故選擇三氯甲烷為待測物的萃取溶劑。

2.4 萃取劑、分散劑、水的體積及萃取時間的選擇

以三氯甲烷為萃取劑，乙腈提取液為分散劑，通過正交實驗進行DLLME測定，以5-甲基糠醛含量計算回收率。

圖4 萃取劑、分散劑、水的體積及萃取時間對回收率的影響Fig.4 The effects of extractant volume,dispersant volume,water volume,extraction time on the recovery rates

由圖4中a可知，萃取劑三氯甲烷的體積大于100 μL時，回收率變化不大，因此選擇萃取劑的體積為100 μL。

由圖4中b可知，分散劑的體積為1.0 mL時萃取效率最高。原因可能是隨著分散劑體積增加，待測物在水中的分散程度增大，溶解度增加，使得萃取效率隨之降低。

由圖4中c可知，隨著水的體積的增加，5-甲基糠醛的回收率不斷上升；當水的用量大于5 mL時，萃取效率隨之下降。原因可能是水的用量過大時，較多萃取劑溶解在水中造成損失，導致萃取效率降低。因此，實驗選擇水的用量為5 mL。

由圖4中d可知，時間為1 min以后快速達到萃取平衡，最佳萃取時間為1 min。

2.5 標準曲線、線性范圍及檢出限

在經(jīng)過優(yōu)化的樣品前處理和GC-MS/MS分析條件下，3種糠醛的檢出限、定量限、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍結(jié)果見表3。3種糠醛在0.002～10 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R>0.999，檢出限LOD以定量離子3倍信噪比(S/N=3)計，定量限LOQ以S/N=10計，可滿足實際樣品的測定。

表3 3種糠醛物質(zhì)的檢出限、定量限、線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 3 The LODs,LOQs,regression equations,correlation coefficients and linear ranges of three furfurals

2.6 方法的添加回收率、精密度

取不含本底的醬油樣品5份，每份2.00 g，分別添加0.1，0.5，10.0 mg/kg 3個水平質(zhì)量濃度的3種糠醛化合物的標準儲備液。按1.3.2的方法測定回收率，每個水平測定5次，結(jié)果見表4。

表4 3種糠醛類物質(zhì)的添加回收率和精密度(n=5)Table 4 The recovery rates and precision of three furfurals (n=5)

結(jié)果顯示：在0.1，0.5，10.0 mg/kg 3個添加水平下，平均回收率為87.6%～100.2%，相對標準偏差(RSD)為2.1%～8.3%，滿足定量分析的要求。

2.7 實際樣品的測定

使用本方法對不同品種醬油中的糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛進行實際檢測。檢驗結(jié)果顯示：糠醛含量在0～1.1 mg/kg，5-羥甲基糠醛含量在0～7.8 mg/kg左右。這可能與食品加工過程中蛋白質(zhì)與糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生糠醛物質(zhì)有關(guān)；也與醬油的釀造發(fā)酵工藝產(chǎn)生糠醛類風味物質(zhì)有關(guān)。

3 結(jié)論

本文將分散液液微萃取技術(shù)與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)相結(jié)合應(yīng)用于醬油中3種糠醛類物質(zhì)的檢測，選擇性好，靈敏度高，操作簡單，沒有繁瑣的凈化和提取過程。目前常用的糠醛類物質(zhì)含量的檢測方法主要有紫外分光光度法和高效液相色譜法，無法檢測到糠醛類化合物含量較低的食品。本方法的檢出限可達0.01 mg/kg，有更高的靈敏度，可以為醬油的加工工藝提供理論基礎(chǔ)，同時為研究監(jiān)測醬油中美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)含量提供了新的思路。