腸道菌群代謝衍生物氧化三甲胺在動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜增生中的作用及機(jī)制

付品婷，鄔光敏，楊俊，朱子健，石殷，陳澄，郭媛媛

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院/云南省阜外心血管病醫(yī)院 血管外科，云南 昆明 650032）

以新生內(nèi)膜高度增生為特征的血管負(fù)性重塑，是動(dòng)脈缺血性疾病血運(yùn)重建后再狹窄的主要原因，抑制新生內(nèi)膜高度增生的方法如血小板生長因子受體拮抗劑、藥物洗脫支架、分子靶向治療（如E2F轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)劑）等在臨床上的應(yīng)用效果并不如預(yù)期所料[1-3]，因此亟需另辟蹊徑，探尋新的調(diào)節(jié)動(dòng)脈損傷后負(fù)性重塑過程的機(jī)制，為解決動(dòng)脈損傷后再狹窄問題提供參考方向。

腸道菌群在維持人體環(huán)境穩(wěn)態(tài)和腸道屏障功能、調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)、影響營養(yǎng)吸收和能量代謝等方面發(fā)揮著重要作用[4-6]，近年研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群衍生的代謝產(chǎn)物氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）水平與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)，TMAO血漿濃度升高具有預(yù)測未來不良心血管疾病結(jié)局的價(jià)值[7-8]。TMAO水平升高會(huì)促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、加劇壓力負(fù)荷引起心力衰竭、或中風(fēng)甚至延長血管緊張素II的作用引起高血壓[7,9-12]，但暫未涉及TMAO水平與動(dòng)脈損傷后重塑過程的調(diào)控關(guān)系。本研究通過建立動(dòng)脈損傷模型，探討腸道菌群代謝物TMAO在動(dòng)脈內(nèi)膜特異性增生過程中的作用機(jī)制，驗(yàn)證TMAO加速動(dòng)脈內(nèi)膜損傷后負(fù)性重塑的假設(shè)。

1 材料與方法

1.1 材料

成年野生型SD大鼠50只，雌雄隨機(jī)，體質(zhì)量350～400 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)中心提供，大鼠均在“昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與操作規(guī)程”下規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作。TSQ Quantum 三重四極桿質(zhì)譜儀，UltiMate 3000 RS色譜儀，美國賽默飛世爾科技；eNOS（AF0096，1:1000，Affinity），p-e NOS（Ser-1177）（AF 3247，1:1000，Affinity），CD31（AF6191，1:200，Affinity）；ROS染液（D7008，1:500，SIGMA）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建大鼠腹主動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠適應(yīng)性單籠飼養(yǎng)1 周，以20 g/L 戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉，顯露腹主動(dòng)脈，于腎動(dòng)脈水平暫時(shí)阻斷血流，逆行將0.014 mm 導(dǎo)絲自髂動(dòng)脈分叉處插至膈肌水平，導(dǎo)絲引導(dǎo)下2.5 mm×20 mm 球囊擴(kuò)張導(dǎo)管插入腹主動(dòng)脈約2～2.5 cm，壓力泵以6 ATM充盈球囊緩慢來回抽動(dòng)2 次，旋轉(zhuǎn)180°再次緩慢來回抽動(dòng)2 次剝脫內(nèi)膜。

1.2.2 分組及處理將50 只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、TMAO 增強(qiáng)組、TMAO 抑制組、糞菌移植組，每組各10 只。模型組僅作腹主動(dòng)脈球囊損傷；TMAO 增強(qiáng)組術(shù)后予1.5%TMAO 水溶液喂養(yǎng)[13]；TMAO 抑制組術(shù)后予1.0%DMB[ 減少三甲胺（trimethylamine，TMA）形成而降低TMAO 水平]水溶液喂養(yǎng)[14]；糞菌移植組按照談路軒等[15]經(jīng)驗(yàn)提取糞菌移植液：取正常大鼠成形新鮮糞便50 g，盡快加入200 mL 生理鹽水，置于攪拌器中進(jìn)行攪拌，經(jīng)2 層無菌紗布去除其中大顆粒物質(zhì)，將樣本置入勻質(zhì)器中，使用逐層縮小的過濾網(wǎng)去除食物殘?jiān)托☆w粒物質(zhì)，將樣本以6000r/min 離心15 min，去除沉淀，取上清1/2 得最終的糞菌液提取液，-20 ℃保存?zhèn)溆茫g(shù)后經(jīng)灌腸途徑予菌液移植治療，每周2 次。所有組每天更換飲用水，直至4 周后取標(biāo)本。

1.2.3 血漿TMAO 檢測取標(biāo)本前禁食12 h，不禁水，常規(guī)麻醉后穿刺腹主動(dòng)脈，將血樣收集到EDTA抗凝血管中，樣品立即3000r/min 離心15 min，血漿-80 ℃保存，采用液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC/MS）測定TMAO 濃度[16]。

1.2.4 組織染色及檢測取血后過量麻醉大鼠致死，迅速取損傷段腹主動(dòng)脈，并將其置于冰鹽水中，清除脂肪和結(jié)締組織，進(jìn)行組織病理染色。應(yīng)用NIH Image J 醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，測量損傷段動(dòng)脈管壁厚度、新生內(nèi)膜厚度（HE 染色）、彈力纖維鑒定（EVG 染色）、血小板- 內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）免疫組化染色，以上染色方法均按云南省阜外心血管病醫(yī)院病理科操作規(guī)程進(jìn)行。Western blot 檢測內(nèi)皮依賴型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和磷酸化eNOS 表達(dá)及免疫熒光測定活性氧（reactive oxygen species，ROS）半定量分析均按試劑盒操作規(guī)程完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

TMAO濃度的色譜圖采集和積分由軟件Xcalibur 3.0（Thermo）進(jìn)行處理，以1/χ2為加權(quán)系數(shù)進(jìn)行線性回歸。各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用IBM SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組間總體比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿TMAO 水平

建模成功后取大鼠動(dòng)脈血，LC/MS測定血漿TMAO濃度。與正常對照組比較，模型組、TMAO增強(qiáng)組、TMAO抑制組血漿TMAO濃度均升高，TMAO增強(qiáng)組升高尤為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；糞菌移植組血漿TMAO濃度較正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。

圖1 LC/MS 檢測血漿TMAO 濃度Figure 1 Plasma TMAO levels determined by LC/MS

2.2 組織染色

建模成功后取損傷段腹主動(dòng)脈，HE染色測量內(nèi)膜（I）+中膜（M）厚度（像素）：正常對照組I+M=450.40±66.42，模型組I+M=775.33±341.49，TMAO增強(qiáng)組I+M=923.73±199.05，TMAO抑制組I+M=636.84±192.46，糞菌移植組I+M=682.88±174.37；與正常對照組比較，各組內(nèi)膜不同程度增厚，可見泡沫細(xì)胞，其中以TMAO增強(qiáng)組內(nèi)膜增生程度最為明顯（均P<0.05），部分管腔可見狹窄近閉塞結(jié)果。EVG染色見正常對照組主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)完整、層次清晰，彈性纖維排列緊密、有序，彈力板結(jié)構(gòu)完整（IOD=131.89±4.40）；與正常對照組比較，模型組（IOD=123.02±3.34）、TMAO增強(qiáng)組（IOD=117.06±3.27）、TMAO抑制組（IOD=124.10±6.65）及糞菌移植組（IOD=121.78±3.24）均可見彈力纖維有不同程度破碎、排列紊亂，彈力板層斷裂、丟失，其中TMAO增強(qiáng)組彈力纖維崩解程度最為明顯（均P<0.05）。CD31是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，對維持血管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接及維持血管完整性具有重要作用。CD31免疫組化染色見：TMAO增強(qiáng)組CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞組化評分最高（H-score=28.59±10.16），但各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）（圖2）。

圖2 各組腹主動(dòng)脈標(biāo)本染色結(jié)果（×200，比例尺：100 μm）Figure 2 Staining results of sample of the abdominal aorta from each(×200,scale bar:100 μm)

2.3 eNOS 和磷酸化eNOS

NO在改善血管內(nèi)皮通透性、抑制內(nèi)膜新生和管壁增厚方面具有重要作用，NO主要由eNOS在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)催化L-精氨酸合成，而絲氨酸1177（Ser1177）磷酸化激活eNOS[17]。為了檢測腹主動(dòng)脈球囊損傷模型中循環(huán)TMAO升高是否會(huì)降低eNOS活性，檢測了損傷段動(dòng)脈組織中的總eNOS和eNOS在絲氨酸第1177 位點(diǎn)磷酸化（p-eNOS Ser1177）的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組總eNOS表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），然而，p-eNOS Ser1177在模型組及TMAO增強(qiáng)組明顯減少，尤其以TMAO增強(qiáng)組降低程度最明顯（均P<0.05），而與正常對照組比較，TMAO抑制組及糞菌移植組磷p-eNOS Ser1177水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）（圖3）。

圖3 Western blot 檢測eNOS 和eNOS Ser1177 的表達(dá)Figure 3 Western blot analysis of expressions of eNOS and p-eNOS Ser1177

2.4 ROS 半定量分析

ROS可以迅速滅活NO，并氧化eNOS輔因子導(dǎo)致eNOS和氧化蛋白的致病解偶，為探究TMAO干預(yù)后是否會(huì)引起損傷段動(dòng)脈ROS變化，利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行ROS檢測，結(jié)果顯示：與正常對照組比較，球囊損傷后動(dòng)脈內(nèi)膜層熒光強(qiáng)度高于中膜-外膜層，模型組、TMAO增強(qiáng)組、TMAO抑制組ROS陽性細(xì)胞數(shù)減低，其中以TMAO組減低程度最大（均P<0.05），而糞菌移植組ROS陽性細(xì)胞數(shù)較正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖4）。

3 討論

血管腔內(nèi)技術(shù)飛速發(fā)展，動(dòng)脈缺血性疾病的治療策略不斷更新，但以新生內(nèi)膜高度增生為特征的血管負(fù)性重塑，最終仍導(dǎo)致大多數(shù)患者出現(xiàn)術(shù)后動(dòng)脈管腔再狹窄，嚴(yán)重影響手術(shù)的遠(yuǎn)期療效。因此，了解導(dǎo)致動(dòng)脈損傷后負(fù)性重塑的機(jī)制，對于臨床制定治療方案，使更多的血管成形術(shù)患者受益具有重要意義。對此諸多學(xué)者研究通過干預(yù)新生內(nèi)膜的某一環(huán)節(jié)以達(dá)到控制血管內(nèi)膜過度增生的目的，H u 等[18]通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)以調(diào)控細(xì)胞再內(nèi)皮化；Yang等[19]研發(fā)的新型雷帕霉素負(fù)載血管移植物、Ye等[20]通過調(diào)控lcnRNA KCNQ1OT1表達(dá)，以干預(yù)血管平滑肌細(xì)胞功能來抑制新生內(nèi)膜形成，但目前還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段；同樣地，鄔光敏等[21]研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定靜脈分子指紋EphB4的持續(xù)表達(dá)能維持靜脈屬性，移植靜脈增生程度降低；再如血小板生長因子受體拮抗劑、藥物洗脫支架、分子靶向治療等，因其費(fèi)用高昂等原因致使在臨床上轉(zhuǎn)化應(yīng)用受限，因此亟需探索新的干預(yù)方向。

機(jī)體攝入的含磷脂酰膽堿的食物，經(jīng)腸道菌群作用形成三甲胺（trimethylamine，TMA），TMA經(jīng)門靜脈循環(huán)進(jìn)入肝臟，在肝臟黃酮單氧化酶作用下迅速氧化生成TMAO，經(jīng)腎小球?yàn)V過和腎小管分泌被腎臟排出[7]。目前大量研究發(fā)現(xiàn)TMAO與心血管不良事件的發(fā)生密切相關(guān)[22-23]，腸道菌群失調(diào)、手術(shù)應(yīng)激都可能導(dǎo)致TMAO產(chǎn)量的增加[24]，Chou等[25]發(fā)現(xiàn)TMAO增加能抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的產(chǎn)生導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，Ke等[13]研究證實(shí)循環(huán)TMAO升高，內(nèi)皮細(xì)胞增殖程度降低，血管功能和重塑能力下降；另外，TMAO亦可引起炎癥反應(yīng)，并加速動(dòng)脈粥樣硬化形成[26-27]。前期大量研究確定了本實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)研究因子在動(dòng)脈損傷后重塑過程作用機(jī)制的可行性，但主要集中于內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為以及TMAO與血管發(fā)育的研究，暫未涉及TMAO與血管損傷后重塑過程的機(jī)制研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腹主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后，血漿TMAO濃度較正常對照組升高，而予菌液治療，調(diào)節(jié)腸道菌群后，血漿TMAO濃度較正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理染色結(jié)果顯示，損傷段腹主動(dòng)脈管腔與正常對照組相比，管腔形態(tài)不規(guī)則，球囊損傷術(shù)后各組均有不同程度新生內(nèi)膜形成，其中以TMAO增強(qiáng)組I+M=923.73±199.05，增生程度最重、彈力纖維IOD=117.06±3.27，崩解程度最為明顯（P<0.001），CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞組化顯示球囊損傷術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞增生，在TMAO增強(qiáng)組中評分最高（H-score=28.59±10.16），說明TMAO干預(yù)后會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞病理性增殖、遷移，促進(jìn)新生內(nèi)膜形成，彈力纖維崩解致管腔舒縮能力降低，管腔負(fù)性重塑加速。TMAO抑制組I+M=636.84±192.46，糞菌移植組I+M=682.88±174.37，新生內(nèi)膜增生程度降低，進(jìn)一步證實(shí)調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)定后TMAO生成減少能減緩受損管腔的負(fù)性重塑。

理想情況下，ECs位于血流和血管壁的邊界，調(diào)節(jié)血管主要的穩(wěn)態(tài)特性，包括止血、溶栓、炎癥反應(yīng)、血管活性、血管通透性和血管重構(gòu)，是血管成形術(shù)后創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵步驟，因此，穩(wěn)定ECs功能是處理動(dòng)脈損傷后的關(guān)鍵點(diǎn)。NO在eNOS作用下形成，經(jīng)ROS滅活，已證實(shí)在改善血管內(nèi)皮通透性、抑制內(nèi)膜新生和管壁增厚方面具有重要作用。為進(jìn)一步探究TMAO引起動(dòng)脈新生內(nèi)膜高度增生的作用機(jī)制，以NO的生成和滅活途徑為研究點(diǎn)，首先，NO主要由eNOS在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)催化L-精氨酸合成，而Ser1177磷酸化激活eNOS[17]，本研究檢測了總eNOS和eNOS Ser1177位點(diǎn)磷酸化表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)各組總eNOS表達(dá)無顯著差異，而eNOS Ser1177位點(diǎn)磷酸化在模型組及TMAO增強(qiáng)組顯著減少，尤其以TMAO增強(qiáng)組降低程度最明顯，而與正常對照組相比，TMAO抑制組及糞菌移植組磷酸化水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明TMAO作用于eNOS Ser1177位點(diǎn)，通過降低其磷酸化影響eNOS活性。但本研究中eNOS Ser1177位點(diǎn)磷酸化水平在TMAO干預(yù)后顯著降低，而總eNOS表達(dá)量無顯著差異，可能的原因是eNOS的活化不僅僅依賴于Ser1177位點(diǎn)磷酸化。既往研究發(fā)現(xiàn)，Thr497磷酸化狀態(tài)可能平衡eNOS刺激產(chǎn)生的NO輸出[28]，Src激酶也可以磷酸化Tyr83上的eNOS，從而激活eNOS[29]，TMAO是否通過多位點(diǎn)磷酸化影響eNOS活性，使eNOS活性處于平衡狀態(tài)需后期再進(jìn)一步研究。除磷酸化以外，TMAO是否會(huì)影響eNOS的脂化、蛋白質(zhì)直接相互作用、糖基化或是亞硝基化，有待進(jìn)一步研究論證。

既往研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激的增加降低了eNOS活性造成NO生物利用度減而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和老化[13-14,30]。為進(jìn)一步探究腹主動(dòng)脈球囊損傷模型中循環(huán)TMAO的升高是否會(huì)引起血管氧化應(yīng)激的變化，本研究對損傷段動(dòng)脈中ROS進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹主動(dòng)脈球囊損傷后，模型組、TMAO增強(qiáng)組、TMAO抑制組ROS陽性細(xì)胞數(shù)均較正常對照組減低，其中以TMAO組減低程度最大，而以菌液治療調(diào)節(jié)腸道菌群后，損傷段動(dòng)脈ROS陽性細(xì)胞數(shù)較正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組ROS變化趨勢與eNOS Ser1177磷酸化變化趨勢一致，證明TMAO降低eNOS Ser1177磷酸化水平可能通過降低ROS產(chǎn)生引起。但這與既往研究氧化應(yīng)激的增加降低了eNOS活性結(jié)果不一致，考慮這可能與ROS的濃度有關(guān)，ROS可能作為第二信使，在高濃度時(shí)能降低eNOS活性，而低濃度時(shí)作為信號(hào)分子，可活化細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增生，維持ROS在適當(dāng)水平才可穩(wěn)定細(xì)胞功能，因此ROS濃度差異對eNOS活性的影響需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，TMAO可能通過eNOS-ROS途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞病理性遷移增殖而加速動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜的增生。