人參二醇對APP-SH-SY5Y細胞中Tau蛋白磷酸化及Fyn/GluN2B信號通路的影響

梁喜才 藺瑩 肖洪賀 孔亮 楊靜嫻

摘要目的：研究人參二醇（PD）對轉(zhuǎn)染APP基因的人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y（APP-SH-SY5Y）中Tau 蛋白磷酸化的影響及其作用機制。方法：采用分子對接技術(shù)驗證PD 與非受體酪氨酸激酶Fyn 的靶向性。在體外培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞，構(gòu)建APP-SH-SY5Y細胞模型和綠色熒光蛋白（GFP）-SH-SY5Y細胞模型（對照細胞），通過檢測細胞中β淀粉樣蛋白（Aβ1-42）的表達來驗證APP-SH-SY5Y細胞模型是否構(gòu)建成功。以GFP-SH-SY5Y細胞為對照，采用CCK-8 法檢測5、10、20、30、40 μmol/L 的PD 和125、250、500、1 000、2 000 nmol/L 的PP2（Fyn 抑制劑，陽性對照）作用24 h 對APP-SH-SY5Y細胞存活率的影響，以確定最佳給藥濃度。以APP-SH-SY5Y細胞為對象，分別檢測最佳濃度PD、PP2 作用24 后細胞中Ca2+濃度及磷酸化Tau 蛋白（p-Tau）/Tau、磷酸化非受體酪氨酸激酶Src（p-Src）/Fyn、磷酸化谷氨酸受體2B（p-GluN2B）/GluN2B比值。結(jié)果：分子模擬對接結(jié)果顯示，PD可靶向結(jié)合Fyn 蛋白。與GFP-SH-SY5Y細胞比較，APP-SH-SY5Y細胞中Aβ1-42蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。PD和PP2 的最佳作用濃度分別為20 μmol/L和500 nmol/L。20 μmol/L PD、500 nmol/L PP2 均可顯著升高細胞的存活率，顯著降低細胞中Ca2+濃度以及p-Tau/Tau、p-Src/Fyn、p-GluN2B/GluN2B比值。結(jié)論：PD可通過抑制Fyn/GluN2B信號通路來降低APP-SH-SY5Y細胞中Ca2+濃度及Tau蛋白的磷酸化水平。

關(guān)鍵詞人參二醇;轉(zhuǎn)染APP基因的人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y;Tau 蛋白;磷酸化;非受體酪氨酸激酶Fyn/谷氨酸受體2B信號通路

ABSTRACT OBJECTIVE：To study the effects and mechanism of panaxadiol（PD） on Tau protein phosphorylation in theSH-SY5Y cells transfected with APP gene（APP-SH-SY5Y）. METHODS：The target of PD and non-receptor tyrosine kinases Fynwas verified by molecular docking. SH-SY5Y cells were cultured in vitro，and the APP-SH-SY5Y cell models and green fluorescent（GFP）-SH-SY5Y cell model（control cell）was constructed. The expression of Aβ 1-42 was detected so as to verify the success ofAPP-SH-SY5Y cell model. Taking GFP-SH-SY5Y cells as control，the effects of 5，10，20，30，40 μmol/L PD and 125，250，500，1 000，2 000 nmol/L PP2（Fyn inhibitor，positive control）on the survival rate of APP-SH-SY5Y cells were detected byCCK-8 assay after treated for 24 h， so as to confirm the optimal concentration. The concentration of Ca2 + ， the ratiofophosphorylated Tau protein（p-Tau）/Tau，phosphorylatedn Src（p-Src）/Fyn and phosphorylated glutamate receptor2B（p-GluN2B）/GluN2B were detected in APP-SH-SY5Y cells after trated with the optimal concentration of PD and PP2 for 24 h. RESULTS：Theresults of molecular simulation docking showed that PD could target Fyn protein. Compared with GFP-SH-SY5Y cells，the proteinexpression of Aβ1-42 in APP-SH-SY5Y cell were increased significantly（P<0.01）. The optimal concentration of PD and PP2 were20 μmol/L and 500 nmol/L. The 20 μmol/L PD and 500 nmol/L PP2 could increase the survival rate of the cells and reduced theconcentration of Ca2 + ，the ratio of p-Tau/Tau，p-Src/Fyn，and p-GluN2B/GluN2B. CONCLUSIONS：PD can reduce the thephosphorylation of Tau protein through inhibiting Fyn/GluN2B signaling pathway.

KEYWORDS Panaxadiol;APP-SH-SY5Y cells;Tau protein;Phosphorylation;Fyn/GluN2B signaling pathway

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一種進行性的神經(jīng)退行性疾病，患者通常會出現(xiàn)以記憶力衰退、學習能力減弱為主的癥狀，并伴有情緒調(diào)節(jié)障礙以及運動能力喪失[1]。目前主流觀點認為，AD的病因與β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）和Tau 蛋白過度磷酸化造成的神經(jīng)元大量死亡而導致的認知缺陷有關(guān)[2]。其中，Tau 蛋白的過度磷酸化是由Aβ神經(jīng)毒性引起的病理生理級聯(lián)反應，而磷酸化的Tau 蛋白同樣影響著Aβ的沉積，進一步協(xié)同產(chǎn)生神經(jīng)毒性，形成惡性循環(huán)，最終導致神經(jīng)系統(tǒng)衰竭、神經(jīng)變性和認知能力下降[3-4]。已有研究證實，Aβ可通過激活非受體酪氨酸激酶Fyn 并開放谷氨酸受體2B（GluN2B）通道，引起Ca2+大量內(nèi)流，進一步誘導Tau 蛋白的過度磷酸化[5-8]?？梢?，F(xiàn)yn/GluN2B信號通路可通過調(diào)控Tau 蛋白的磷酸化而影響AD的發(fā)生與發(fā)展。

人參二醇（panaxadiol，PD）是從人參Panax ginsengC. A. Mey.中提取得到的一種三萜皂苷類單體化合物，是人參的三大苷元之一，在人參總皂苷水解物中的含量高達8.75%[9]。PD 具有多種藥理作用，包括抗癌、抗缺氧損傷、抗自由基等[10-13]。同時，PD對Aβ?lián)p傷的神經(jīng)元具有保護作用[14-15]。APP基因是較早被發(fā)現(xiàn)的AD患者腦內(nèi)的突變基因之一，表達APP基因的細胞系能夠分泌高水平的Aβ，該細胞系已被廣泛用于AD的研究[16]。本課題組前期成功構(gòu)建了APP 基因轉(zhuǎn)染的人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y（APP-SH-SY5Y 細胞）來模擬Aβ沉積致AD發(fā)病的細胞模型，并發(fā)現(xiàn)PD對該細胞具有神經(jīng)保護作用，但其保護機制尚不明確。鑒于此，本研究擬考察PD 對APP-SH-SY5Y 細胞中Tau 蛋白磷酸化及Fyn/GLuN2B信號通路的影響，以期為PD防治AD提供新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

Ti-S 型熒光顯微鏡購自日本Nikon 公司;TGL-20M型臺式高速冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器公司;NU-4750E型CO2培養(yǎng)箱購自美國Nuaire 公司;MR-96A型酶標儀購自美國Molecular Devices 公司;UV-5600 型紫外-可見光分光光度計購自上海元析儀器有限公司;Tanon-5200 型自動化學發(fā)光圖像分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

PD 對照品（批號19666-76-3，純度98.36%）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;Fyn 抑制劑PP2 對照品（陽性對照，批號172889-27-99，純度>98%）購自美國MedchemExpress 公司;DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶消化液和青霉素/鏈霉素（P/S）雙抗均購自美國Gibco 公司;綠色熒光蛋白（GFP）-APP 質(zhì)粒、GFP質(zhì)粒以及pLP1 質(zhì)粒、pLP2 質(zhì)粒、pLP/VSV-G質(zhì)粒均由本課題組前期自行構(gòu)建;脂質(zhì)體-2000 轉(zhuǎn)染試劑、聚凝胺轉(zhuǎn)染增強劑均購自美國Invitrogen 公司;全蛋白提取試劑盒（批號KGP250）、BCA 法蛋白定量檢測試劑盒（批號KGP902）、CCK-8 法細胞增殖檢測試劑盒（批號KGA317）均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;CalbryteTM520 AM試劑盒（批號21131）購自美國AAT Bioquest公司;兔抗鼠、Fyn 多克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司;兔抗鼠磷酸化Src（p-Src）多克隆抗體購自美國RD 公司;兔抗鼠A β 1-42 GluN2B、磷酸化（p-GluN2B）、Tau、磷酸化Tau（p-Tau）多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體購自美國Abcam 公司;辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗購自武漢ABclonal 公司;熒光素Cy3 標記的驢抗兔IgG 二抗購自美國Jackson 公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為去離子水。

1.3 細胞

人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y、人源胚胎腎細胞293T（human emborynic kidney 293T，HEK 293T）均由首都醫(yī)科大學提供。

2 方法

2.1 PD與Fyn蛋白的分子模擬對接

以“panaxadiol”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https：//tcmspw.com）中檢索得到PD 的二維結(jié)構(gòu)，保存為“mol2”格式文件;以“Fyn”為關(guān)鍵詞，通過PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）檢索并下載Fyn 的蛋白結(jié)構(gòu)，保存為“mol2”格式文件。將兩者的“mol2”格式文件分別導入AutoDockTools-1.5.6 軟件中，調(diào)整X、Y、Z 坐標軸并用Autodock vina 1.1.2 軟件進行模擬對接。對接完成后，用Discovery Studio 2017 軟件顯示對接后的作用力，并以對接評分來評估結(jié)合親和力。若評分<-4.0，則認為化合物與靶點蛋白具有較強的親和力[17]。以Fyn 抑制劑PP2 為陽性對照，同法進行PP2與Fyn蛋白的分子模擬對接。

2.2 APP-SH-SY5Y細胞模型的構(gòu)建

將GFP（或GFP-APP）質(zhì)粒15 μg、pLP1 質(zhì)粒6.5 μg、pLP2 質(zhì)粒2.5 μg、pLP/VSV-G 質(zhì)粒3.5 μg 與DMEM 高糖培養(yǎng)基250 μL 混合均勻，在室溫下孵育5 min。用脂質(zhì)體-2000 介導轉(zhuǎn)染HEK 293T 包裝細胞，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h 時收集上述HEK 293T 細胞培養(yǎng)液的上清液。將上述上清液混合后，以3 000 r/min 離心20 min 去除細胞碎片，然后以0.22 μm濾膜過濾，濾液用100 kDa超濾管以5 000 r/min 離心1 h，得到濃縮液。再將SH-SY5Y細胞以1×106個/孔接種于6 孔板中，待細胞生長至密度為70%時，棄去培養(yǎng)液;加入0.5 mL上述濃縮液、0.5 mL不完全培養(yǎng)基（不含P/S 和FBS 的DMEM高糖培養(yǎng)基）和聚凝胺轉(zhuǎn)染增強劑（10 μg/mL）適量后，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱（下同）中常規(guī)培養(yǎng)12 h，然后換成完全培養(yǎng)基（含P/S 和FBS 的DMEM高糖培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)至第3 天時，將培養(yǎng)基換為含有嘌呤霉素（4 μg/mL）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 天換液1 次，培養(yǎng)1周后用于實驗。

2.3 APP-SH-SY5Y細胞模型構(gòu)建情況的驗證

采用Western blot 法進行檢測。取第2 代APP-SHSY5Y細胞和GFP-SH-SY5Y細胞，分別以1×106個/孔接種至6 孔板中，分別作為APP組和GFP組（對照組）。常規(guī)培養(yǎng)12 h 后，根據(jù)全蛋白提取試劑盒說明書方法提取細胞中總蛋白，采用BCA法對蛋白進行定量后，在沸水浴中煮沸5 min 進行變性。取變性后蛋白（20 μg）進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒壓80 V，電泳時間2.5 h），然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上（電壓80 V 轉(zhuǎn)印0.5 h）。用5%脫脂奶粉封膜1 h，加入Aβ1-42（稀釋比例為1 ∶ 400）、β-actin（稀釋比例為1 ∶ 2 000）一抗，4 ℃孵育過夜;TBST 緩沖液洗膜5 min×4 次，加入HRP 標記的IgG 二抗（稀釋比例為1 ∶800），室溫孵育1h。ECL顯色后，用全自動化學發(fā)光圖像分析儀拍照，保存。以β-actin 為內(nèi)參，采用Image J 1.51 軟件檢測條帶灰度值，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達水平。實驗重復3 次。

2.4 PD和PP2 給藥濃度的考察

采用CCK-8 法檢測細胞存活率，以確定PD 和PP2的最佳給藥濃度。將APP-SH-SY5Y細胞以1×104個/孔接種到96 孔板中（含完全培養(yǎng)基，下同），然后將其分為不同濃度的PD（5、10、20、30、40 μmol/L，濃度依據(jù)前期預實驗結(jié)果設置）組（記為“APP+PD組”）和不同濃度的Fyn 抑制劑PP2（125、250、500、1 000、2 000 nmol/L，濃度依據(jù)前期預實驗結(jié)果設置）組（記為“APP+PP2 組”），每組均設置3 個復孔;同時，另設加入GFP-SH-SY5Y細胞的對照組（記為“GFP 組”）和空白組。經(jīng)相應培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，向每孔中加入CCK-8 溶液10 μL，常規(guī)孵育2h。然后，使用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔的吸光度（A），并計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。實驗重復3次。

2.5 細胞中Ca2+濃度的檢測

采用CalbryteTM 520 AM 探針法進行檢測。將APP-SH-SY5Y 細胞分別以1×104 個/孔接種到96 孔板中，然后將其分為GFP 組、APP 組、APP+PD組（PD濃度為20 μmol/L）和APP +PP2 組（PP2 濃度為500 nmol/L），每組設置3 個復孔。分別處理24 h 后，根據(jù)CalbryteTM520 AM 試劑盒說明書方法操作，使用熒光顯微鏡在610～640 nm波長范圍內(nèi)掃描各孔的熒光情況并檢測其熒光強度，以此反映Ca2+濃度[18]。實驗重復3次。

2.6 細胞中Fyn、GluN2B、Tau蛋白磷酸化水平的檢測

采用免疫細胞化學法進行檢測。將APP-SH-SY5Y細胞分別以1×104個/孔接種到96 孔板中，按“2.5”項下方法進行分組、處理24 h 后，向各孔中分別加入4%多聚甲醛溶液50 μL，在4 ℃條件下固定30 min。細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，然后用0.1%Triton X-100 試劑在室溫下透化5 min;再用PBS 洗滌3 次，然后分別加入相應一抗（Fyn 稀釋比例為1 ∶ 500，p-Src 稀釋比例為1 ∶800，GluN2B、p-GluN2B 稀釋比例均為1 ∶1 000，Tau、p-Tau 稀釋比例均為1 ∶400）50 μL，4 ℃孵育過夜;吸棄培養(yǎng)液，用PBS 洗滌細胞3 次，再加入熒光素Cy3 標記的IgG 二抗（稀釋比例為1 ∶200，室溫下孵育1 h;加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）試劑，室溫避光孵育15 min，用PBS 洗滌3 次。使用熒光顯微鏡拍攝照片，然后用Image J 1.51 軟件測定細胞的熒光強度，以磷酸化蛋白和總蛋白熒光強度的比值表示該蛋白的磷酸化水平。實驗重復3 次。

2.7 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 5 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果以x±s 表示，兩組間比較采用t 檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 PD與Fyn蛋白的分子模擬對接結(jié)果子對接結(jié)果顯示，PD、PP2 與Fyn 蛋白的氨基酸殘基均可以形成較強的氫鍵（PD 的對接評分=-9.5;PP2 的對接評分=-9.1），兩者具有很好的空間及電性互補特征，易于形成穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象。該結(jié)果表明，PD與Fyn 蛋白具有強相互作用，脫靶可能性較小，可為后續(xù)實驗驗證提供理論依據(jù)。PD、PP2 與Fyn 蛋白的分子對接2D圖見圖1。

3.2 APP-SH-SY5Y細胞模型的建立情況分析結(jié)果與GFP組（0.21±0.11）比較，APP組細胞中Aβ1-42蛋白的表達水平（0.82±0.08）顯著升高（P<0.01），表明APP-SH-SY5Y細胞模型構(gòu)建成功。GFP組和APP組細胞的熒光顯微圖見圖2（圖中，白光表示白光鏡下圖，熒光表示GFP熒光圖，合并表示兩者的合并圖），Aβ1-42蛋白表達的電泳圖見圖3。

3.3 PD和PP2 給藥濃度的篩選結(jié)果與GFP組比較，APP組細胞的存活率顯著降低（P<0.01）。與APP 組比較，各給藥組細胞的存活率均顯著升高（P<0.05 或P<0.01）;且組間比較發(fā)現(xiàn)，當PD濃度達到20 μmol/L、PP2 濃度達到500 nmol/L 時，再增加藥物濃度后細胞的存活率均無顯著變化（P>0.05），因此以20 μmol/L PD和500 nmol/L PP2 進行后續(xù)實驗。各組細胞存活率的檢測結(jié)果見表1。

3.4 各組細胞中Ca2+濃度的檢測結(jié)果與GFP組比較，APP組細胞中Ca2+的濃度顯著增強（P<0.01）;與APP組比較，APP+PD、APP+PP2 組細胞中Ca2+的濃度均顯著減弱（P<0.01）。各組細胞中Ca2+濃度的檢測結(jié)果見表2、其顯微圖見圖4（圖中，綠色表示GFP熒光;紅色表示CalbryteTM 520熒光;合并為兩者合成圖）。

3.5 各組細胞中Tau蛋白磷酸化水平的檢測結(jié)果與GFP 組比較，APP 組細胞中p-Tau/Tau 比值顯著升高（P<0.01）;與APP組比較，APP+PD、APP+PP2 組細胞中p-Tau/Tau 比值均顯著降低（P<0.05）。各組細胞中Tau 蛋白磷酸化水平的檢測結(jié)果見表3，其熒光顯微圖見圖5。

3.6 各組細胞中Fyn/GluN2B 信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的檢測結(jié)果與GFP組比較，APP組細胞中p-Src/Fyn、p-GluN2B/GluN2B 比值均顯著升高（P<0.01）;與APP 組比較，APP+PD、APP+PP2 組細胞中上述指標比值均顯著降低（P<0.05）。各組細胞中Fyn/GluN2B 信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的檢測結(jié)果見表3，其熒光顯微圖見圖6。

4 討論

據(jù)2019 年的一項研究指出，我國約有1 450 萬AD患者，隨著人口老齡化的加劇，AD的患病率也將不斷上升，預計到2050 年，我國AD患者將超過3 000 萬[19]。AD病因復雜，學術(shù)界至今仍未完全闡明其發(fā)病的具體機制。有研究認為，Tau 蛋白的過度磷酸化是AD病機之一，p-Tau 蛋白的積累會造成神經(jīng)元的死亡并導致記憶喪失[2]。然而，Tau 病理學的發(fā)展是一個復雜的多因素過程，減少AD患者腦中Tau 蛋白磷酸化的機制仍有待進一步深入研究。有研究表明，Tau 蛋白的磷酸化與Fyn活性有關(guān)，F(xiàn)yn 的激活可促進APP 轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Tau蛋白的磷酸化，而抑制Fyn 活性則可減少其Tau 蛋白的磷酸化[20]。這提示，抑制Fyn 活性可緩解AD 的病理進展。

本研究先通過分子模擬對接發(fā)現(xiàn)，PD與Fyn 蛋白具有強烈的親和力，提示PD 可靶向抑制Fyn 蛋白活性。接著，本研究構(gòu)建了APP-SH-SY5Y細胞模型來驗證PD能否通過抑制Fyn 活性從而發(fā)揮對AD的改善作用。該細胞模型可以模擬AD患者腦內(nèi)Aβ對神經(jīng)系統(tǒng)的損害，包括降低細胞存活率、促進乳酸脫氫酶釋放、誘導細胞凋亡等[21-22]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)PD干預后，APP-SHSY5Y細胞的存活率顯著升高;同時，筆者還觀察到APP-SH-SY5Y細胞中Ca2+濃度顯著增加，這可進一步引起Tau 蛋白的磷酸化[5-8]，而PD和Fyn抑制劑PP2 均可降低APP-SH-SY5Y細胞中Ca2+濃度及Tau 蛋白的磷酸化水平。

為了闡明PD抑制Tau 蛋白磷酸化的潛在機制，筆者進一步驗證了Fyn/GluN2B 信號通路相關(guān)蛋白在APP-SH-SY5Y 細胞中的表達情況。結(jié)果顯示，在APP-SH-SY5Y細胞中，Aβ引起了Fyn/GluN2B信號通路的激活;而PD和PP2 干預24 h 后，APP-SH-SY5Y細胞中p-Tau/Tau、p-Src/Fyn（Fyn是Scr 家族中的一員，p-Src/Fyn比值可反映Fyn 蛋白的磷酸化水平）、p-GluN2B/GluN2B比值均顯著降低。這提示，PD可通過抑制Fyn/GluN2B信號通路阻斷Aβ引起的神經(jīng)毒性，從而降低Tau 蛋白的磷酸化水平。

綜上所述，PD可通過抑制Fyn/GluN2B信號通路抑制APP-SH-SY5Y細胞中Tau 蛋白的磷酸化，為PD治療AD提供了科學依據(jù)。但本研究僅從激活Fyn 的角度闡述了PD 的可能作用機制，未在其沉默條件下進行驗證。在后續(xù)實驗中，筆者將采用APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠為AD動物模型，在體內(nèi)深入探討PD對該模型小鼠腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化的影響。

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（收稿日期：2020-12-01 修回日期：2021-04-08）

（編輯：林靜）