不同炮制時(shí)間的荊芥炭色度值與多項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性研究

田甜 彭幫貴 徐杰 洪婉敏 劉路芳 何海兵 魏梅

摘 要 目的：研究不同炮制時(shí)間（0～40 min，下同）的荊芥炭色度值與多項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性，揭示荊芥炭在炮制過(guò)程中的質(zhì)量變化規(guī)律，確定炮制終點(diǎn)時(shí)間。方法：測(cè)定不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片中醇溶性浸出物的含量;建立荊芥飲片及不同炮制時(shí)間荊芥炭飲片的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)色譜峰;采用相同的UPLC條件測(cè)定不同炮制時(shí)間荊芥炭飲片中指標(biāo)成分（橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮）的含量;運(yùn)用色差儀測(cè)定不同炮制時(shí)間荊芥炭飲片的色度值，以炮制0 min樣品為對(duì)照，計(jì)算總色值（E）和總色差值（ΔE）。對(duì)荊芥炭飲片中醇溶性浸出物、指標(biāo)成分含量及色譜峰峰面積與色度值參數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析、聚類分析和正交偏最小二乘法判別分析。確定荊芥炭炮制終點(diǎn)時(shí)間并驗(yàn)證。結(jié)果：隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，荊芥炭飲片中醇溶性浸出物的含量逐漸降低。12批荊芥飲片中共標(biāo)定17個(gè)色譜峰，與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.9。不同炮制時(shí)間荊芥炭飲片中共標(biāo)定21個(gè)色譜峰，與炮制0 min樣品圖譜的相似度隨著炮制時(shí)間延長(zhǎng)而降低，其中炮制18 min后的相似度均低于0.9。確認(rèn)色譜峰峰9為橙皮苷、峰10為迷迭香酸、峰17為胡薄荷酮。含量和色度值測(cè)定結(jié)果顯示，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮含量均逐漸降低，荊芥炭飲片粉末顏色L、b、E值均逐漸減小，a、ΔE值均逐漸增大。Pearson相關(guān)性分析顯示，荊芥炭飲片中醇溶性浸出物含量、橙皮苷含量、迷迭香酸含量、胡薄荷酮含量以及15個(gè)色譜峰（峰2、7～15、17～21）的峰面積與E值成顯著正相關(guān)（P<0.01），5個(gè)色譜峰（峰1、3～6）的峰面積與E值成顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），而峰16的峰面積與E值無(wú)關(guān)（P>0.05）。聚類分析結(jié)果顯示，不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片被分成2類，炮制0～16 min為第1類、18～40 min為第2類。正交偏最小二乘法判別分析結(jié)果顯示，荊芥炭飲片的峰6峰面積（2.800 75）、L值（2.327 54）、峰3峰面積（1.793 39）、b值（1.735 78）、峰5峰面積（1.244 04）的變量投影重要性（VIP值）均大于1。荊芥炭炮制終點(diǎn)時(shí)間為18 min;3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，荊芥炭飲片的L、a、b值分別為20.22～22.00、4.44～7.67、9.78～13.00，ΔE為13.50～14.12。結(jié)論：不同炮制時(shí)間荊芥炭飲片的色度值與其醇溶性浸出物含量、橙皮苷含量、迷迭香酸含量、胡薄荷酮含量以及20個(gè)色譜峰的峰面積密切相關(guān)。建議荊芥炭炮制終點(diǎn)時(shí)間為18 min。

關(guān)鍵詞 荊芥;荊芥炭;炮制時(shí)間;超高效液相色譜法;指紋圖譜;色度值;含量;相關(guān)性

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the correlation of the chromaticity value of Schizonepeta tenuifolia charcoal of different processing time （0-40 min， similarly hereinafter） with multiple indicators， and to reveal the quality change law of S. tenuifolia charcoal during processing and confirm the terminal time. METHODS： The contents of ethanol-soluble extracts from S. tenuifolia charcoal decoction pieces of different processing time were determined. UPLC fingerprint of S. tenuifolia decoction pieces and S. tenuifolia charcoal decoction pieces of different processing time were established， and the similarity evaluation was also conducted. The chromatographic peaks were confirmed by comparison with substance control. The same UPLC conditions were used to determine the contents of index components （hesperidin， rosmarinic acid， menthone） in S. tenuifolia charcoal decoction pieces of different processing time. The colorimetric method was used to measure the chromaticity value of S. tenuifolia charcoal decoction pieces of different processing time. Meanwhile， sample of processing 0 min was used as a control to calculate the total color value （E） and the total color difference value （ΔE）. ?Pearson correlation analysis， cluster analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） were performed on the ethanol-soluble extracts， index component contents， chromatographic peak area and chromaticity value. The terminal time of processing S. tenuifolia charcoal was confirmed， and validation test was also conducted. RESULTS： With the extension of processing time， the content of ethanol-soluble extract in S. tenuifolia charcoal decoction pieces gradually decreased. A total of 17 chromato- graphic peaks were identified in 12 batches of S. tenuifolia decoction piece， and its similarity with the control fingerprint was greater than 0.9. 21 chromatographic peaks were identified in S. tenuifolia charcoal decoction pieces of different processing time， and its similarity with the chromatogram of sample of processing 0 min decreased with the processing time， and the similarity after 18 min was lower than 0.9. The chromatographic peak 9 was hesperidin， peak 10 was rosmarinic acid and peak 17 was menthone. The determination of content and chromaticity value showed that with the extension of processing time， the contents of hesperidin， rosmarinic acid and menthone decreased gradually; the color L， b and E values of S. tenuifolia charcoal decoction piece powder decreased gradually， and the a and ΔE values increased gradually. Pearson correlation analysis showed that the contents of ethanol-soluble extract， hesperidin， rosmarinic acid and menthone， the peak areas of 15 chromatographic peaks （peak 2， 7-15， 17-21） were significantly positively correlated with E value （P<0.01）; the peak areas of 5 chromatographic peaks （peak 1， 3-6） were significantly negatively correlated with E value （P<0.01）， but peak area of peak 16 was not related to E value （P>0.05）. Results of cluster analysis showed that S. tenuifolia charcoal decoction pieces of different processing time were divided into 2 categories; the first category was processed for 0-16 min， and the second category was processed for 18-40 min. The results of OPLS-DA showed that the VIP values of peak 6 area （2.800 75）， L value （2.327 54）， peak 3 area （1.793 39）， b value （1.735 78） and peak 5 area （1.244 04） were greater than 1. The final processing time of S. tenuifolia charcoal was 18 min. The results of validation experiment showed that the L， a and b values of S. tenuifolia charcoal decoction piece were 20.22-22.00， 4.44-7.67， 9.78-13.00， and ΔE were 13.50-14.12， respectively. CONCLUSIONS： The chromaticity value of S. tenuifolia charcoal decoction pieces of different processing time is closely related to the contents of ethanol-soluble extract， hesperidin， rosmarinic acid， menthone and the area of 20 chromatographic peaks. It is suggested that the terminal time of processing S. tenuifolia is 18 min.

KEYWORDS ? Schizonepeta tenuifolia; Schizonepeta tenuifolia charcoal; Processing time; UPLC; Fingerprint; Chromaticity value; Content; Correlation

荊芥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，別名假蘇，為唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分。該藥多在夏、秋二季花開(kāi)到頂、穗綠時(shí)采割，除去雜質(zhì)，曬干。其味辛、性微溫，歸肺、肝經(jīng)，具有解表散風(fēng)、透疹、消瘡的功效，可用于治療感冒、頭痛、麻疹、風(fēng)疹、瘡瘍初起等病癥[1]。荊芥主要含有揮發(fā)油類、黃酮及其苷類、萜類、酚類、甾醇類等化學(xué)成分，具有抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、止血等藥理作用，是傳統(tǒng)中藥材之一[2]。

荊芥經(jīng)炒炭后，辛散作用減弱，專于收斂止血，常用于便血、崩漏、產(chǎn)后血暈的各種出血證[3]。2020年版《中國(guó)藥典》（一部）收載了荊芥、荊芥炭?jī)煞N飲片，并規(guī)定荊芥炭飲片的炮制方法如下：取荊芥段，照炒炭法（2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0213）炒至表面焦黑色，內(nèi)部焦黃色，噴淋清水少許，熄滅火星，取出，晾干[1，4]。傳統(tǒng)的外觀控制認(rèn)為飲片表面焦黑色、內(nèi)部焦黃色即符合荊芥炒炭標(biāo)準(zhǔn)[5]。這種感官評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)主觀性太強(qiáng)，缺少客觀數(shù)據(jù)，容易導(dǎo)致炮制程度不一、荊芥炭飲片的質(zhì)量難以有效控制。

已有研究表明，色度值可為中藥飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)和炮制工藝評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持和參考，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于中藥領(lǐng)域[6-8]。本研究通過(guò)測(cè)定荊芥炭炮制過(guò)程中醇溶性浸出物含量、指紋圖譜、指標(biāo)成分（橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮）含量和粉末的色度值，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法對(duì)色度值與多項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，揭示荊芥炭在炮制過(guò)程中的質(zhì)量變化規(guī)律，為快速評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括HP-C220型精密色差儀（深圳漢普光彩科技有限公司），UPLC H-Class型超高效液相色譜（UPLC）儀（美國(guó)Waters公司），C21-WK2102型多功能電磁爐（美的集團(tuán)有限公司），111B型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司），ME204E型萬(wàn)分之一天平、XP26型百萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），HWS28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），Milli-Q-Direct超純水系統(tǒng)[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]，KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DHG-9147A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

橙皮苷（批號(hào)110721-201818，純度96.2%）、迷迭香酸（批號(hào)111871-201706，純度90.5%）、胡薄荷酮（批號(hào)111706-201907，純度99.8%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇（分析純）購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司;乙醇（分析純）購(gòu)自天津富宇精細(xì)化工有限公司;乙腈（色譜純）購(gòu)自默克化工技術(shù)（上海）有限公司;磷酸（色譜純）購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

12批荊芥飲片由廣東一方制有限公司提供，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師和廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二中醫(yī)院孫冬梅教授鑒定均為唇形科植物荊芥S. tenuifolia Briq.的干燥地上部分，其來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 荊芥炭飲片樣品的制備

取荊芥飲片（編號(hào)S8），按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0213項(xiàng)下的荊芥炭炮制方法規(guī)定[4]，置熱鍋內(nèi)，用武火炒制40 min，從炮制0 min起，每隔2 min進(jìn)行取樣，同時(shí)用紅外測(cè)溫儀測(cè)定出鍋溫度，放涼，即得荊芥炭飲片（編號(hào)JT00～JT20）。

2.2 醇溶性浸出物測(cè)定

按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則2201項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定荊芥炭飲片（編號(hào)JT00～JT20）中的浸出物[4]，溶劑為70%乙醇。結(jié)果，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，荊芥炭飲片的醇溶性浸出物含量逐漸減少，詳見(jiàn)表2。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 色譜條件 以Waters CORTECS UPLC T3（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～6 min，10%A;6～11 min，10%A～13%A;11～14 min，13%A～15%A;14～27 min，15%A～20%A;27～46 min，20%A～30%A;46～56 min，30%A～50%A;56～66 min，50%A～60%A），流速為0.30 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2 ?L。

2.3.2 單一對(duì)照品溶液的制備 取橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含橙皮苷61.361 ?g、迷迭香酸31.675 ?g、胡薄荷酮61.756 ?g的單一對(duì)照品溶液，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 取荊芥飲片粉末（過(guò)二號(hào)篩，下同）0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.3”項(xiàng)下同一供試品溶液（編號(hào)S1）適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以橙皮苷色譜峰為參照，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.5%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液（編號(hào)S1）6份，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以橙皮苷色譜峰為參照，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.3.3”項(xiàng)下同一供試品溶液（編號(hào)S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以橙皮苷色譜峰為參照，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.5%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 指紋圖譜的建立和色譜峰的指認(rèn) 取荊芥飲片（編號(hào)S1～S12）和不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片（編號(hào)JT00～JT20），按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將色譜圖分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A版）》，以編號(hào)S1樣品和編號(hào)JT00樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜，將時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行峰匹配，建立荊芥飲片和不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片的UPLC疊加指紋圖譜，采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R）。結(jié)果，12批荊芥飲片共標(biāo)定17個(gè)色譜峰，不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片共標(biāo)定21個(gè)色譜峰。與對(duì)照品（“2.3.2”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液以“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)得）比對(duì)，確定峰9為橙皮苷、峰10為迷迭香酸、峰17為胡薄荷酮，詳見(jiàn)圖1～圖3。

2.3.8 荊芥飲片的相似度評(píng)價(jià) 以荊芥飲片的對(duì)照指紋圖譜為對(duì)照，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A版）》對(duì)12批荊芥飲片的指紋圖譜進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，12批荊芥飲片指紋圖譜的相似度依次為0.902、0.993、0.980、0.993、0.967、0.952、0.916、0.914、0.966、0.990、0.985、0.995，均大于0.9，表明12批荊芥飲片與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性，飲片批間差異較小。

2.3.9 荊芥炭飲片的相似度評(píng)價(jià) 以編號(hào)JT00樣品圖譜為對(duì)照，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A版）》對(duì)不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片（編號(hào)JT01～JT20）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，荊芥炭飲片指紋圖譜與編號(hào)JT00樣品圖譜的相似度逐漸降低;當(dāng)炮制18 min后，兩者的相似度低于0.9;至炮制40 min時(shí)，相似度僅為0.396，詳見(jiàn)表3。

2.3.10 炮制時(shí)間對(duì)荊芥炭飲片色譜峰的影響 對(duì)比圖1和圖2可知，12批荊芥飲片中均未能檢測(cè)到峰3、5～6、16，但經(jīng)炮制后峰3、5～6、16均逐漸被檢測(cè)到，說(shuō)明此4個(gè)色譜峰可能為荊芥炒炭后的新增成分，可作為區(qū)分荊芥飲片與荊芥炭飲片的關(guān)鍵指標(biāo)。通過(guò)比較不同炮制時(shí)間荊芥炭飲片色譜峰的峰面積發(fā)現(xiàn)，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，峰1、3～6的峰面積逐漸增加，峰2、14～16的峰面積先增加后減小，其余12個(gè)峰的峰面積逐漸減小。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 同“2.3.1”項(xiàng)。

2.4.2 單一對(duì)照品溶液的制備 同“2.3.2”項(xiàng)。

2.4.3 供試品溶液的制備 同“2.3.3”項(xiàng)。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，得系列混合對(duì)照品溶液。分別吸取上述混合對(duì)照品溶液適量，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，?g/mL）、對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮的回歸方程分別為y=11 100.0x-1 958.9、y=4 866.8x-2 375.7、y=15 794.0x-57 036.0，R 2分別為0.999 2、0.999 5、0.999 9，表明橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮質(zhì)量濃度分別在1.227～19.636、0.634～10.136、1.235～19.762 ?g/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.4.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮質(zhì)量濃度分別為9.818、5.068、9.881 ?g/mL）適量，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮峰面積的RSD分別為0.77%、0.89%、2.40%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.4.3”項(xiàng)下同一供試品溶液（編號(hào)S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮峰面積的RSD分別為0.94%、0.70%、3.20%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.4.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液（編號(hào)S1）6份，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮含量的RSD分別為0.63%、0.79%、0.81%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的荊芥飲片粉末（編號(hào)S1）9份，每份0.5 g，精密稱定，分別按對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)成分量之比0.5 ∶ 1、1 ∶ 1、1.5 ∶ 1精密加入橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮對(duì)照品（各比例均平行3次），按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮的平均加樣回收率分別為95.88%、96.79%、95.65%，RSD分別為1.15%、0.58%、1.54%（n=9），表明該方法回收率良好。

2.4.9 樣品含量測(cè)定 取不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片（編號(hào)JT00～JT20）粉末，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮的含量。結(jié)果，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮含量均逐漸降低，詳見(jiàn)表4。

2.5 色度值的測(cè)定

2.5.1 測(cè)定方法 取不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片（編號(hào)JT00～JT20）粉末（過(guò)三號(hào)篩，下同），作為供試品。采用精密色差儀測(cè)定色度值：黑白校正后將供試品分別壓制于載玻片上，壓制厚度約為1 mm;測(cè)定條件為D65光源，8°視角，孔徑8 mm，LED藍(lán)光激發(fā)，儀器誤差值小于0.4，記錄供試品的色度值（L、a、b值代表物體顏色的色度值，其中L值越大表示顏色越亮/淺，a值越大表示顏色越偏紅，b值越大表示顏色越偏黃[9]）。各樣品平行測(cè)定3次，取平均值。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取荊芥炭飲片（編號(hào)JT01）粉末，按“2.5.1”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6次，記錄色度值。結(jié)果，其L、a、b值的RSD均小于3.0%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取荊芥炭飲片（編號(hào)JT01）粉末6份，按“2.5.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色度值。結(jié)果，其L、a、b值的RSD均小于2.5%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取荊芥炭飲片（編號(hào)JT01）粉末，按“2.5.1”項(xiàng)下方法分別壓制于載玻片上，在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)測(cè)定色度值。結(jié)果，其L、a、b值的RSD均小于2.0%（n=8），表明樣品在室溫下放置24 h內(nèi)色度值的穩(wěn)定性良好。

2.5.5 總色值和總色差值計(jì)算 取不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片（編號(hào)JT00～JT20）粉末，按“2.5.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色度值并計(jì)算各樣品的總色值[E=（L2+a2+b2）1/2]、總色差值[ΔE，與編號(hào)JT00樣品比較，ΔL=L樣品-L0，Δa=a樣品-a0，Δb=b樣品-b0，ΔE=（ΔL2+Δa2+Δb2）1/2;式中，L0、a0、b0均為編號(hào)JT00樣品的色差值][9-10]，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，荊芥炭飲片在炮制過(guò)程中E值隨炮制時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減小，主要與L、b值明顯減小有關(guān)。L、b值逐漸減小，表明炮制過(guò)程中飲片粉末的明亮度由明變暗，藍(lán)色加深;a值逐漸增大，表明炮制過(guò)程中飲片粉末紅色加深。荊芥炭飲片在炮制過(guò)程中ΔE值隨炮制時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。按照CIELAB均勻色空間系統(tǒng)理論，當(dāng)ΔE相差6～12個(gè)色差單位時(shí)，其色差可被人眼識(shí)別[9-11];當(dāng)ΔE≥12時(shí)，荊芥炭飲片的外觀顏色符合《中國(guó)藥典》相關(guān)要求[1]。當(dāng)炮制18 min后，荊芥炭飲片的ΔE值均大于12;且隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，荊芥炭飲片的ΔE值進(jìn)一步增大。

2.6 炮制過(guò)程中荊芥炭顏色與成分動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析

2.6.1 Pearson相關(guān)性分析 利用SPSS 20.0軟件對(duì)不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片（編號(hào)JT00～JT20）中醇溶性浸出物含量、指標(biāo)成分含量、色譜峰峰面積與各色度值參數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可見(jiàn)，荊芥炭飲片中醇溶性浸出物含量、橙皮苷含量、迷迭香酸含量、胡薄荷酮含量以及15個(gè)色譜峰（峰2、7～15、17～21）的峰面積與E值成顯著正相關(guān)（P<0.01），5個(gè)色譜峰（峰1、3～6）的峰面積與E值成顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），而峰16的峰面積與E值無(wú)關(guān)（P>0.05）。

2.6.2 聚類分析和偏正交最小二乘法判別分析 將不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片（編號(hào)JT00～JT20）的色度值參數(shù)、醇溶性浸出物含量、指標(biāo)成分含量及色譜峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行聚類分析和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），從而預(yù)測(cè)影響荊芥炭飲片中成分變化的重要變量。聚類分析結(jié)果顯示，不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片被分成了2類，其中炮制時(shí)間0～16 min的聚為第1類、18～40 min的聚為第2類，詳見(jiàn)圖4。OPLS-DA結(jié)果顯示，模型參數(shù)累積貢獻(xiàn)率（R 2）為0.949，預(yù)測(cè)優(yōu)度系數(shù)（Q 2）為0.898，均大于0.5，表明此模型為優(yōu)質(zhì)模型，可用于變量的預(yù)測(cè);通過(guò)此模型預(yù)測(cè)得到5個(gè)變量投影重要性（VIP值）均大于1的變量，分別是峰6峰面積（2.800 75）、L值（2.327 54）、峰3峰面積（1.793 39）、b值（1.735 78）、峰5峰面積（1.244 04），詳見(jiàn)圖5。上述5個(gè)變量的變化程度較為明顯，其中通過(guò)L、b值可以直觀判斷荊芥炭飲片的炮制終點(diǎn)。

2.7 荊芥炭炮制的終點(diǎn)時(shí)間確定與驗(yàn)證

在確保荊芥炭飲片符合《中國(guó)藥典》相關(guān)外觀性狀要求的前提下[1]，為避免因炮制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致的橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮含量下降，故本研究選擇荊芥炭飲片炮制終點(diǎn)時(shí)間為18 min。按照炮制時(shí)間為18 min的炮制工藝對(duì)3批荊芥飲片（編號(hào)S3～S5）進(jìn)行炮制，按“2.5.1”項(xiàng)下方法測(cè)定其色度值并計(jì)算ΔE值。結(jié)果，經(jīng)過(guò)18 min炮制后，所得荊芥炭飲片的L、a、b值分別為20.22～22.00、4.44～7.67、9.78～13.00，ΔE為13.50～14.12，詳見(jiàn)表7。

3 討論

顏色和表觀性狀是中藥材及飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。傳統(tǒng)上，中藥炮制過(guò)程及炮制終點(diǎn)的色澤評(píng)價(jià)方法主要是經(jīng)驗(yàn)鑒別及直觀判斷，容易受主觀個(gè)體差異和不敏感性的影響，造成產(chǎn)品質(zhì)量的差異[9-13]。由于色度值能客觀、準(zhǔn)確地體現(xiàn)荊芥炭炮制過(guò)程中的顏色動(dòng)態(tài)變化，因此本研究以不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片粉末為對(duì)象，運(yùn)用精密色差儀對(duì)其表觀顏色進(jìn)行量化，結(jié)果更具客觀性。由色度值分析結(jié)果可知，隨炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，荊芥炭飲片粉末的顏色逐漸加深，L、b、E值均逐漸減小，a、ΔE值均逐漸增大，粉末顏色由黃綠色逐漸變成焦黑色，炮制程度可被肉眼識(shí)別，與傳統(tǒng)性狀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)較為一致[13]?？梢?jiàn)，將主觀化經(jīng)驗(yàn)判定的顏色描述轉(zhuǎn)化為客觀的檢測(cè)數(shù)據(jù)，可對(duì)荊芥炭炮制過(guò)程中的質(zhì)量變化進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為荊芥炭炮制過(guò)程的質(zhì)量控制及快速評(píng)價(jià)提供新的手段。

本研究結(jié)合色度值、UPLC指紋圖譜、浸出物及多指標(biāo)含量等對(duì)不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片進(jìn)行了多元統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)比較荊芥飲片及不同炮制時(shí)間的荊芥炭飲片的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)荊芥經(jīng)過(guò)炒炭，UPLC指紋圖譜存在較大差異。荊芥飲片的UPLC指紋圖譜未能檢測(cè)到峰3、5～6、16，而經(jīng)炮制后上述成分被檢出，推測(cè)峰3、5～6、16可能為炮制后荊芥炭新產(chǎn)生的化合物。隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，荊芥炭飲片中橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮等12個(gè)色譜峰的峰面積較荊芥飲片逐漸減小，表明荊芥飲片所含化學(xué)成分在炒炭后發(fā)生了變化。荊芥飲片經(jīng)過(guò)炒炭后，辛散作用減弱，產(chǎn)生止血作用，因此猜測(cè)峰3、5～6、16這4種新產(chǎn)生的化合物可能與止血的藥效密切相關(guān)[13]，后續(xù)擬進(jìn)一步驗(yàn)證。

Pearson相關(guān)性結(jié)果顯示，醇溶性浸出物含量、橙皮苷含量、迷迭香酸含量、胡薄荷酮含量以及15個(gè)色譜峰（峰2、7～15、17～21）的峰面積與E值成顯著正相關(guān)，5個(gè)色譜峰（峰1、3～6）的峰面積與E值成顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明荊芥炭飲片的成分與其粉末色度值具有緊密相關(guān)性。OPLS-DA結(jié)果顯示，L、b值的VIP值均大于1，a值的VIP值接近1，說(shuō)明L、a、b值是荊芥炭炮制過(guò)程中的重要變量，通過(guò)測(cè)定色度值可以預(yù)測(cè)荊芥炭飲片的炮制程度，以實(shí)現(xiàn)對(duì)荊芥炭炮制質(zhì)量的控制。本研究結(jié)果顯示，炮制18 min以上的荊芥炭飲片的ΔE均大于12，且隨炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮的含量逐漸減少，綜合考慮確定炮制終點(diǎn)為18 min。然而，顏色與藥效水平的關(guān)系還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為荊芥炭飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更全面的數(shù)據(jù)支撐。

綜上所述，荊芥炭飲片粉末的色度值與其醇溶性浸出物含量、橙皮苷含量、迷迭香酸含量、胡薄荷酮含量以及20個(gè)色譜峰的峰面積密切相關(guān)。建議荊芥炭飲片炮制終點(diǎn)時(shí)間為18 min。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：243.

[ 2 ] 劉英男，牛鳳菊，辛義周，等.荊芥的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2020，31（11）：1397- 1402.

[ 3 ] 吳皓，李飛.中藥炮制學(xué)[M]. 2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2016：225.

[ 4 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：31-32，232.

[ 5 ] 高明亮，藍(lán)錦珊，單鳴秋，等.中藥炭藥研究進(jìn)展與研究策略思考[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，36（5）：696-703.

[ 6 ] 黃瑤，張雪蘭，羅宇琴，等.山萸肉及其不同酒制品的UPLC特征圖譜建立及色度值的差異性研究[J].中國(guó)藥房，2021，32（2）：206-213.

[ 7 ] 黃夢(mèng)婷，潘玲，鄧?yán)罴t，等.基于UPLC指紋圖譜與色度值的桑白皮生品和炮制品的鑒別及炮制終點(diǎn)研究[J].中國(guó)藥房，2021，32（1）：56-63.

[ 8 ] 楊麗，龔燚婷，許銘珊，等.基于“表里關(guān)聯(lián)”的大黃炭炮制過(guò)程顏色和成分變化關(guān)系研究[J].中草藥，2020，51（22）：5705-5713.

[ 9 ] 孟慶安，劉恩順.實(shí)現(xiàn)中藥顏色客觀化表達(dá)的研究思路探討[J].天津中醫(yī)藥，2014，31（11）：696-699.

[10] 張雪，李曉慶，王云，等.焦梔子炒制過(guò)程中HPLC圖譜變化與外觀顏色的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)研究[J].中草藥，2018，49（17）：4029-4037.

[11] 干麗，鐘如帆，魏梅，等.狗脊炮制工藝優(yōu)選及色度值測(cè)定[J].中成藥，2020，42（9）：2382-2388.

[12] 楊麗，溫雅心，劉洋，等.大黃炭加熱過(guò)程顏色特征與14種化學(xué)成分含量變化關(guān)系研究[J].中國(guó)中藥雜志，2020，45（17）：4230-4237.

[13] 儲(chǔ)兆錚，王淑英，易劍平，等.荊芥炒炭成分變化趨勢(shì)初探[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2019，30（8）：1886-1888.

（收稿日期：2021-02-03 修回日期：2021-05-11）

（編輯：鄒麗娟）