中耳黏膜的掃描電鏡樣品制備方法的改進(jìn)

首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室（100069）姬曼 趙君朋

掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）具有分辨率高、視野大、景深長(zhǎng)和立體感強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，SEM既可以在低放大倍數(shù)下觀察樣品整體的三維結(jié)構(gòu)，也可以通過高倍放大研究樣品表面超微形貌特點(diǎn)，因此SEM是研究組織細(xì)胞表面微細(xì)結(jié)構(gòu)研究的一種必不可少的工具[1]。中耳（聽泡）解剖位置深邃，位于顳骨巖部，中耳黏膜上皮起源于內(nèi)胚層，附于周圍骨或軟骨組織表面，腔內(nèi)的立體結(jié)構(gòu)錯(cuò)綜復(fù)雜[2][3]。由于黏膜層薄而骨組織較厚且細(xì)胞的含水量不同，樣品制備過程中組織收縮性不同，骨組織脫水變脆，極易發(fā)生形變損毀，從而導(dǎo)致附著黏膜層斷裂和細(xì)胞表面的變形失真[3]。因此，對(duì)中耳黏膜組織進(jìn)行大視野、立體結(jié)構(gòu)觀察時(shí)，保持組織完整性是困擾SEM工作者的棘手問題。本研究嘗試在樣品制備環(huán)節(jié)引入脫鈣處理，取得了比較理想的效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本取材 3只健康SD大鼠（體重250～300g），稱重后腹腔內(nèi)注射6%水合氯醛（30mg/kg）麻醉，經(jīng)鼓膜注入2.5%戊二醛1～2ml后斷頭處死動(dòng)物，取出聽泡。

1.2 掃描電鏡標(biāo)本的制備 分別用兩種方法處理組織塊：①正常對(duì)照組：樣品用緩沖液沖洗黏液和血跡后，2.5%戊二醛固定6h，在解剖鏡下分離得到咽鼓管和鼓室部位組織，入1%四氧化鋨固定1h，然后依次經(jīng)50%、70%、80%、90%、95%和100%乙醇梯度脫水，每次5min；最后放入臨界點(diǎn)干燥儀中，處理1.5h；干燥后的樣品粘于樣品臺(tái)上，經(jīng)離子濺射儀鍍膜，于掃描電子顯微鏡下觀察并記錄。②脫鈣處理組：樣品用緩沖液沖洗黏液和血跡后，首先2.5%戊二醛固定6h，在解剖鏡下分離得到咽鼓管和鼓室部位組織，置10%EDTA溶液中（4℃）脫鈣處理12h，后續(xù)處理同對(duì)照組。

2 結(jié)果

掃描電鏡下觀察顯示：中耳黏膜中主要有纖毛細(xì)胞、無纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞及扁平細(xì)胞組成。纖毛細(xì)胞表面分布豐富的纖毛；無纖毛細(xì)胞表面具有短的微絨毛；杯狀細(xì)胞表面附有分泌黏液滴。扁平細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，表面分布有短微絨毛。在中耳腔的不同部位，各種細(xì)胞的比例有顯著不同。纖毛細(xì)胞主要分布在咽鼓管下壁，而鼓呷部和后鼓室相對(duì)較少。鼓室口下壁分布叢狀纖毛細(xì)胞，纖毛上皮間可見無纖毛細(xì)胞，無纖毛細(xì)胞表面可見大量微絨毛，但幾乎看不到扁平細(xì)胞（附圖1）。咽鼓管峽部，纖毛分布致密，纖毛密而長(zhǎng)，形成纖毛毯，纖毛細(xì)胞間有一些分泌黏液的杯狀細(xì)胞分布。扁平細(xì)胞多為六邊形，表面平坦有微絨毛，細(xì)胞邊界清晰，呈鑲嵌排列（附圖2），多分布于后鼓室、鼓岬后部及鼓膜松弛部。此外，鏡下可見常規(guī)處理樣品，黏膜表面可見明顯龜裂紋（附圖1B，附圖2B）；EDTA脫鈣處理組樣品，隨著脫鈣時(shí)間的延長(zhǎng)，黏膜表面龜裂紋明顯減少，黏膜中纖毛細(xì)胞、無纖毛細(xì)胞表面形貌特征與對(duì)照組無明顯差異（附圖1A，附圖2A）。

附圖1 中耳咽鼓管鼓室口處黏膜掃描電鏡觀察。A脫鈣處理組；B正常對(duì)照組。bar=10um

附圖2 乳突氣房黏膜掃描電鏡觀察。A脫鈣處理組；B正常對(duì)照組。bar=10um

3 討論

中耳黏膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜精巧，且深埋于顳骨巖部，聽泡周圍骨質(zhì)精細(xì)脆弱，在制備過程中極易損毀變形，因此中耳黏膜掃描電鏡樣品制備不易成功[2][3]。本研究借鑒骨組織切片中脫鈣處理原理，利用脫鈣液使骨組織充分脫鈣，以保證樣品結(jié)構(gòu)的完整性。骨組織一種堅(jiān)硬且有韌性的結(jié)締組織，它由鈣化的細(xì)胞外基質(zhì)即骨基質(zhì)和骨細(xì)胞構(gòu)成。傳統(tǒng)的骨組織脫鈣處理采用強(qiáng)酸溶液脫鈣，雖然脫鈣速度快，但造成組織細(xì)胞腫脹或碎裂等問題，影響觀察結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實(shí)性[4][5]。以乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）為代表的螯合劑類脫鈣液可以通過與骨組織中鈣離子的結(jié)合達(dá)到脫鈣目的，雖對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及抗原免疫活性影響最小，但其脫鈣時(shí)間明顯長(zhǎng)于酸類脫鈣液[4][5]。

本研究首先用2.5%戊二醛前固定，再入EDTA脫鈣液中脫鈣處理。固定是整個(gè)組織處理過程的關(guān)鍵，電鏡樣品制備一般多用戊二醛固定。戊二醛一方面可對(duì)組織完全徹底的固定，可以使樣品在脫鈣過程中組織結(jié)構(gòu)免受破壞。另一方面，有研究表明戊二醛可以加大脫鈣液的穿透力而加快脫鈣速度[5]。所以，在前固定后立即進(jìn)行EDTA脫鈣處理，既有保護(hù)組織的結(jié)構(gòu)又能縮短脫鈣時(shí)間，從而使樣品制備既快又好，節(jié)約時(shí)間和成本。掃描電鏡下觀察，EDTA脫鈣處理后黏膜細(xì)胞超微形貌特征無變化，且樣品碎裂現(xiàn)象有明顯改善。此方法也對(duì)其他骨性組織樣品制備均有一定的借鑒意義。