包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的制備及抑菌效果

倪蘊(yùn)琪，唐靜儀，洪 惠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

牦牛Bosgrunniens是中國(guó)青藏高原及其毗鄰高山、亞高山高寒地區(qū)的特有珍稀牛種之一[1]。作為牦牛肉加工過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，牦牛骨鈣質(zhì)豐富，是目前市面上優(yōu)質(zhì)的小分子骨膠原肽來源[2]。多肽螯合鈣是第3代具有活性結(jié)構(gòu)的生物鈣補(bǔ)鈣制劑，穩(wěn)定性好，抗干擾能力強(qiáng)，吸收效果好，生物利用度高。甘林火等[3]發(fā)現(xiàn)：L-亮氨酸螯合鈣的生物利用度比葡萄糖酸鈣要高，具有緩釋、藥效時(shí)間長(zhǎng)、不需要消耗胃酸等特點(diǎn)。植物來源的精油可以作為調(diào)味劑和天然防腐劑，肉桂精油具有清除自由基、抗油脂氧化的作用和較強(qiáng)的抗菌能力[4]，是對(duì)抗常見食源性病原體的最有效精油之一[5]，主要成分為肉桂醛，此外還含有丁子香酚、芳樟醇和α-pine烯等[6]。HUANG等[7]發(fā)現(xiàn)：肉桂精油抗菌活性高，能有效抑制微生物生長(zhǎng)，延長(zhǎng)草魚Ctenopharyngodonidellus魚片保質(zhì)期。OJAGH等[8]發(fā)現(xiàn)富含肉桂油的殼聚糖涂層延長(zhǎng)了虹鱒魚Oncorhynchusmykiss冷藏期間的保質(zhì)期。本研究利用牦牛骨資源，制備包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物，探討其對(duì)水產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌維氏氣單胞菌Aeromonasveronii的緩釋抑菌作用，為水產(chǎn)品的防腐保鮮提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

木瓜蛋白酶購(gòu)自安琪酵母股份有限公司；維氏氣單胞菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院水產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室提供；牦牛骨購(gòu)自國(guó)肽生物科技(北京)有限公司；肉桂精油購(gòu)自江西恒城天然香料油有限公司。肉桂精油的添加使用遵照GB 2760?2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的相關(guān)規(guī)定[9]。

1.2 牦牛骨蛋白肽和可溶性牦牛骨鈣的制備

參考魏潔瓊等[10]方法并稍作修改。破碎后的牦牛骨粒經(jīng)高壓滅菌鍋蒸煮3.0 h；冷卻后除去油脂，過濾得到骨渣和濾液。骨渣∶鹽酸 (1.0 mmol·L?1)以 1∶50(m∶V)酸溶 15 h[11]，蒸發(fā)濃縮，EDTA 滴定后用去離子水稀釋得到2.0 mmol·L?1的可溶性牦牛骨鈣，備用。濾液濃縮，冷凍干燥，得到牦牛骨蛋白；去離子水溶解，調(diào)節(jié)至 60 ℃，pH 7.0[12?13]，木瓜蛋白酶 (4 000×16.67 nkat·g?1)酶解 2.0 h[14]，95 ℃ 水浴滅酶20 min，冷卻后離心，取上清液濃縮后冷凍干燥，即為牦牛骨蛋白肽。

1.3 包埋肉桂精的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的制備

參照HONG等[15]方法并稍作修改。牦牛骨膠原蛋白肽用去離子水溶解成10.0 g·L?1蛋白肽溶液，離心去除沉淀。在使用均質(zhì)儀(德國(guó)IKA)均質(zhì)的同時(shí)向牦牛骨蛋白肽溶液中逐滴加入牦牛骨鈣溶液，得到牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物。量取10 mL牦牛骨蛋白肽溶液，分別加入0(對(duì)照)、10、15、20、25、30 μL肉桂精油，在均質(zhì)的同時(shí)逐滴加入 1 mL 0(對(duì)照)、0.5、1.0、2.0 mmol·L?1牦牛骨鈣溶液，得到包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物[16]。

1.4 牦牛骨蛋白肽分子量的測(cè)定

參照XIE等[17]方法，通過分子量排阻的高效液相色譜法(SE-HPLC)，使用液相色譜儀(日本島津)測(cè)定牦牛骨蛋白肽分子量[18]。儀器參數(shù)：TSK凝膠 G2000SWXL柱 (7.8 mm×300.0 mm)，進(jìn)樣量25.0 μL，流速 0.5 mL·min?1，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng) 214 nm。以三氟乙酸-水-乙腈 (體積比為 0.1∶54.9∶45.0)為流動(dòng)相。標(biāo)準(zhǔn)物為細(xì)胞色素 C(12.362 kDa)，抑肽酶 (6.5114 kDa)，桿菌肽 (1.423 kDa)，Gly-Gly-Tyr-Arg(四肽，0.451 kDa)和Gly-Gly-Gly(三肽，0.189 kDa)。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)物分子量(M)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，建立保留時(shí)間和分子量對(duì)數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 牦牛骨蛋白肽多肽序列的鑒定

使用Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛)對(duì)樣品進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)全掃描，質(zhì)荷比為 100～1 990 Da[19]。使用 Peaks studio 8.0 軟件結(jié)合 Mascot MS/MS 搜索 SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定牦牛骨多肽序列[20]。

1.6 牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的特性表征

根據(jù)AKBARI等[16]和ZHANG等[21]方法稍作修改，使用可見分光光度計(jì)每隔10 min測(cè)定1次牦牛骨蛋白肽原始溶液、牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物和去離子水乳化的牦牛骨蛋白肽(對(duì)照)的吸光度(600 nm)，計(jì)算相對(duì)濁度，研究蛋白肽鈣螯合物的穩(wěn)定性。計(jì)算公式為：相對(duì)濁度=(Ax?A0)/A0×100%。其中：Ax為不同條件下制得的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物(或?qū)φ?的吸光度，A0為牦牛骨蛋白肽原始溶液的吸光度。

每隔2 h測(cè)定1次包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的吸光度(600 nm)[22]，以牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物為對(duì)照，研究肉桂精油對(duì)螯合物穩(wěn)定性的影響。

使用ZS90納米粒徑電位分析儀(英國(guó)，馬爾文)在25 ℃下通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)定螯合物的平均粒徑和多分散指數(shù)(PDI)[21]。

1.7 包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的緩釋效果檢驗(yàn)

采用感官評(píng)價(jià)法和抑菌活性測(cè)定緩釋效果。取包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物和去離子水稀釋的等比例肉桂精油樣品各1份，室溫下靜置24 h后，參考朱紅梅等[23]進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官指標(biāo)評(píng)分表如表1所示。參照周子雄等[24]的方法并稍作修改測(cè)定抑菌活性?；罨^夜的維氏氣單胞菌菌液[25?26]調(diào)整至 106CFU·mL?1，取 4 份 25 mL 受試菌菌懸液，分別加入 100 μL 已滅菌的包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物、牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物、肉桂精油和去離子水(對(duì)照)，震蕩混勻。每隔2 h測(cè)定1次菌懸液吸光度(600 nm)，檢測(cè)螯合鈣的抑菌效果。抑菌率=(Ac?At)/Ac×100%。其中：Ac為對(duì)照組的吸光度，At為不同處理?xiàng)l件下的吸光度。

表 1 感官評(píng)價(jià)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of sensory evaluation

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用RStudio 1.3.107 3軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，差異顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛骨蛋白肽分子量

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：lgM=7.013 8+0.226 9t，計(jì)算得到不同分子量區(qū)間的蛋白肽占總蛋白的比例。由表2可知：酶解后的牦牛骨蛋白肽肽段的分子量均小于3.0 kDa，其中分子量小于1.0 kDa的牦牛骨蛋白肽占全部肽段的95.867%，說明牦牛骨蛋白肽多為小分子肽。

表 2 牦牛骨蛋白肽的分子量Table 2 Molecular weight of yak bone peptides

2.2 牦牛骨蛋白肽多肽序列

LC-MS/MS測(cè)序發(fā)現(xiàn)：牦牛骨蛋白肽主要成分為膠原Ⅰ蛋白α1鏈和α2鏈，分別含肽段336和285條，肽段覆蓋率為55%。共測(cè)得945個(gè)肽段序列信息，相對(duì)分子量為306～1 032 Da，組成肽段的氨基酸為7～37個(gè)。對(duì)其中分子量小于1.0 kDa且可信度較高的33條蛋白肽段(表3)進(jìn)一步的分析，牦牛骨蛋白肽可用于制備具備緩釋殺菌功能的鈣螯合物。

表 3 牦牛骨蛋白肽部分多肽序列鑒定結(jié)果Table 3 Identification of partial peptides sequences of yak bone peptides

2.3 包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的特性表征

2.3.1 螯合物的相對(duì)濁度 由圖1可知：除加入去離子水并乳化的牦牛骨蛋白肽(對(duì)照)外，不同濃度牦牛骨鈣溶液制成的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的相對(duì)濁度存在顯著差異(P＜0.05)。隨牦牛骨鈣溶液濃度增加，蛋白肽-鈣螯合物相對(duì)濁度增加，但不同沉降時(shí)間下相對(duì)濁度變化不大，說明鰲合效果良好，螯合物穩(wěn)定，可以用于混合乳液的制備，后續(xù)研究選用2.0 mmol·L?1牦牛骨鈣溶液制備鰲合物。由圖2可知：除牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物(對(duì)照)外，添加不同體積肉桂精油制成的包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的吸光度存在顯著差異(P＜0.05)。當(dāng)添加的肉桂精油大于20 μL時(shí)，螯合物吸光度隨時(shí)間急劇下降，穩(wěn)定性較差；添加的肉桂精油小于20 μL時(shí)，螯合物吸光度變化不大，說明穩(wěn)定性較好。因此后續(xù)研究以10 mL牦牛骨蛋白肽中加入20 μL肉桂精油為螯合時(shí)肉桂精油的適宜添加量。

圖 1 牦牛骨鈣溶液濃度對(duì)牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物穩(wěn)定性的影響Figure 1 Stability of yak bone peptides-calcium chelate prepared by different yak bone calcium solution

圖 2 不同肉桂精油添加量對(duì)包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物穩(wěn)定性的影響Figure 2 Stability of yak bone peptides-calcium chelate prepared by different ratio of cinnamon essential oil

2.3.2 顆粒大小與分散性 由圖 3 可知：牦牛骨蛋白肽的粒徑為167.8 nm，牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的粒徑為368.2 nm，包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的粒徑為780.2 nm，三者差異顯著(P＜0.05)；牦牛骨蛋白肽、牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物及包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的多分散指數(shù)沒有顯著性差別(P＞0.05)，且包埋肉桂精油的螯合物多分散指數(shù)小于0.2，螯合物分散性較好。

圖 3 螯合物的粒徑和多分散指數(shù)Figure 3 Particle size and polydispersity coefficient of emulsion of cinnamon essential oil and yak bone peptides-calcium chelate

2.4 包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的緩釋效果

2.4.1 感官評(píng)價(jià) 由表4可知：包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的總體評(píng)分為7.22分，即該螯合物表觀狀態(tài)良好，分散均一，無分層，色澤一致，無雜質(zhì)，肉桂香濃郁、風(fēng)味純正，氣味較協(xié)調(diào)，無不良?xì)馕?，其中“香氣”?xiàng)的分值顯著高于肉桂精油稀釋液(P＜0.05)。

表 4 感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Artificial sensory evaluation results

2.4.2 抑菌效果 由圖 4 可知：在 2 h 后，對(duì)照和牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的吸光度明顯上升，維氏氣單胞菌大量繁殖；相比之下，牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物的吸光度值增速更快，12 h抑菌率為?13.70%，推測(cè)是牦牛骨蛋白肽為菌的繁殖提供營(yíng)養(yǎng)。肉桂精油稀釋液和包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物都表現(xiàn)出了良好的抑菌效果，12 h抑菌率分別為70.24%和77.33%。螯合物對(duì)維氏氣單胞菌的6 h抑菌率為61.41%，且6 h后抑菌率始終高于肉桂精油稀釋液，說明螯合物抑菌效果較為穩(wěn)定。

圖 4 肉桂精油和螯合物對(duì)維氏氣單胞菌的抑菌效果Figure 4 Bacteriostatic effect of cinnamon essential oil and yak bone peptides-calcium chelate on Aeromonas veronii

3 討論

人體從外界攝取的蛋白類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解后多以小分子肽的形式被吸收利用，肽的螯合能力受分子量影響；相比之下，小分子肽內(nèi)部活性基團(tuán)和螯合位點(diǎn)暴露程度較大，與鈣離子的接觸機(jī)率也較大[27]。本研究中得到的多數(shù)牦牛骨蛋白肽分子量小于1.0 kDa，屬于小分子肽，因此適用于鈣螯合物的制備。

本研究發(fā)現(xiàn)：大量牦牛骨蛋白肽在pH小于7時(shí)帶負(fù)電荷，有利于蛋白肽側(cè)鏈與鈣離子間的靜電吸引，當(dāng)負(fù)電荷被鈣離子中和時(shí)，中性蛋白肽受到疏水作用影響，形成蛋白肽-鈣螯合物。同時(shí)，牦牛骨蛋白肽中還存在大量的脯氨酸(P)和甘氨酸(G)；HAINES-BUTTERICK等[28]發(fā)現(xiàn)：脯氨酸和甘氨酸通常依次出現(xiàn)在β-折疊的邊緣鏈或β-發(fā)夾中，這種蛋白質(zhì)超二級(jí)結(jié)構(gòu)有助于形成球形結(jié)構(gòu)[29]，可被應(yīng)用于藥物的釋放[30]。因此，牦牛骨蛋白肽可用于制備具緩釋殺菌功能的鈣螯合物。

濁度是評(píng)價(jià)多肽螯合鈣螯合程度的重要指標(biāo)之一[21]，與螯合物粒徑正相關(guān)；當(dāng)懸浮液濁度達(dá)到原始分散體的50%且隨著鈣離子濃度增加不再形成沉淀物時(shí)，被認(rèn)為螯合鈣形成良好[19]。AKBARI等[16]發(fā)現(xiàn)：隨著鈣離子濃度增加，螯合物的粒徑增加。ZHANG等[21]發(fā)現(xiàn)：高濃度鈣離子可以平衡肽的負(fù)電荷，形成沉淀或附聚物(肽-鈣螯合物)。本研究中，隨著牦牛骨鈣溶液濃度增加，相對(duì)濁度顯著升高，且未生成沉淀物，與AKBARI等[16]結(jié)論一致；因此，使用2.0 mmol·L?1牦牛骨鈣溶液可形成螯合鈣，且穩(wěn)定性良好。

多分散指數(shù)(PDI)可用來表征納米乳液粒子的分布情況，PDI越小表示乳液粒子分布越均勻[31]。本研究中，通過高速剪切法向牦牛骨蛋白肽溶液中加入牦牛骨鈣溶液，粒徑明顯增加，PDI較小，說明有新的物質(zhì)形成，即生成了肽-鈣螯合物，且分散性較好；繼續(xù)加入肉桂精油，乳液粒徑出現(xiàn)顯著增加，推斷是形成了包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物。

人工感官評(píng)定是最基礎(chǔ)的食品質(zhì)量評(píng)價(jià)方法[32]。本研究制備的包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物在各項(xiàng)評(píng)價(jià)中表現(xiàn)良好，且“香氣”項(xiàng)分值顯著高于肉桂精油稀釋液，與肉桂精油稀釋液相比，靜置24 h后肉桂香更濃郁，認(rèn)為螯合物有一定的緩釋作用。

微生物是食物腐敗的主要原因，抑制微生物生長(zhǎng)是延長(zhǎng)保質(zhì)期和提高水產(chǎn)品質(zhì)量的有效方法，氣單胞菌是水產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[33]。本研究中，包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物對(duì)氣單胞菌表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，與HUANG等[7]結(jié)果相符。隨時(shí)間增長(zhǎng)，螯合物抑菌效果逐漸優(yōu)于肉桂精油稀釋液，說明螯合物具有緩釋效果，延長(zhǎng)了抑菌時(shí)間，有助于延長(zhǎng)水產(chǎn)品的貨架期。

4 結(jié)論

本研究利用牦牛骨資源制備包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物；通過分析螯合物相對(duì)濁度，確定制備條件；通過測(cè)定牦牛骨蛋白肽分子量，分析牦牛骨蛋白肽序列，確認(rèn)牦牛骨蛋白肽適用于螯合物的制備，并推斷螯合物形成機(jī)制為牦牛骨蛋白肽的負(fù)電荷與鈣離子間產(chǎn)生靜電吸引作用，受疏水作用影響形成球形肽-鈣螯合物；通過測(cè)定粒徑、多分散指數(shù)和濁度，表征螯合物特性，確認(rèn)螯合物的形成；通過測(cè)定抑菌率和感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-鈣螯合物抑菌效果良好，且具有緩釋作用，為新型抑菌劑的開發(fā)提供思路。