• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    桂花OfNAC轉錄因子鑒定及在花開放階段的表達分析

    2021-07-12 10:44:12繆云鋒趙宏波
    浙江農林大學學報 2021年3期
    關鍵詞:擬南芥桂花花瓣

    繆云鋒,周 丹,董 彬,趙宏波

    (1.浙江農林大學 浙江省園林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室,浙江 杭州 311300;2.浙江農林大學 南方園林植物種質創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室,浙江 杭州 311300;3.浙江農林大學 風景園林與建筑學院,浙江 杭州 311300)

    NAC(NAM-ATAF1/2-CUC2)是植物中最大的轉錄因子家族之一,成員眾多,功能多樣[1]。NAC轉錄因子參與植物多個生物學過程,如植物莖尖分生組織的形成[2]、植物次生生長[3]、組織愈合過程中的細胞增殖[4]、生物和非生物脅迫響應[5?6]、植物開花時間調節(jié)[7?8]、葉片和花瓣衰老[9]和果實成熟時顏色變化等[10]?;ò昙毎纳扉L和擴展也受到NAC轉錄因子的調控。花瓣的擴展是引起植物花開放的重要原因[11?13],主要受花瓣細胞的膨壓變化、細胞壁代謝變化等影響[14]。研究發(fā)現(xiàn):NAC轉錄因子NAP可能通過抑制擬南芥Arabidopsisthaliana花瓣細胞擴張而影響花器官生長,且在花發(fā)育細胞分裂向細胞擴展過渡階段發(fā)揮重要作用[15]。RhNAC3可以作為上游調控因子結合具有調節(jié)滲透壓功能的基因從而影響月季Rosahybrida花瓣細胞擴張[16]。桂花Osmanthusfragrans是中國傳統(tǒng)的十大名花之一,花是其最重要的觀賞器官。桂花花的開放受到溫度、濕度等環(huán)境因子的影響,其具體的分子機制至今尚未闡明。本研究通過桂花NAC家族基因鑒定和篩選,預測它們的理化性質,運用熒光定量PCR分析花開放進程中的表達模式,篩選出參與桂花花開放調控的關鍵NAC轉錄因子成員,為明確其在花開放中的功能作用奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    以桂花品種‘堰虹桂’O.fragrans‘Yanhonggui’盆栽植株為材料,種植于浙江農林大學桂花資源圃。選取株齡相同、生長一致的健康植株,分別于起始期(S1)以及花開放不同階段:圓珠期(S2)、頂殼期(S3)、鈴梗期(S4)、初開期(S5)、盛花期(S6)進行取樣[17]。每個時期樣品采集3份,取樣時間均為10:00,液氮速凍后儲藏于?80 ℃冰箱備用。

    1.2 方法

    1.2.1 桂花OfNAC轉錄因子的鑒定及理化性質分析 本研究從已構建的桂花‘堰虹桂’轉錄組數(shù)據(jù)庫[18]中對NAC轉錄因子進一步進行NCBI-Blast(http://www.ncbi.nLm.nih.gov/BLAST/)比對分析。通過PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php)以及Pfam(https://pfam.xfam.org/)查詢候選基因中的NAC的結構域,并通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進行保守功能域預測,利用TBtools工具進行桂花NAC保守結構域可視化分析,TBtools-ORF finder分析開放閱讀框[19],并通過NCBI-Blast獲得開放閱讀框完整的桂花OfNAC序列。運用ExPASy在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預測編碼蛋白質分子量、理論電點、酸堿性等。

    1.2.2 桂花OfNAC轉錄因子結構和亞細胞定位預測分析 用DNAMAN對已篩選的桂花OfNAC轉錄因子氨基酸序列進行比對,分析其保守亞結構域;在線分析軟件MEME 5.1.0分析NAC的保守基序(http://meme-suite.org/tools/meme),對桂花OfNAC蛋白質二級結構以及跨膜結構分別采用在線軟件SOPMA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-sopma.html)和 TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行分析。用在線分析軟件 Wolfp sort Genscript(https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar)進行亞細胞定位預測。

    1.2.3 桂花OfNAC轉錄因子系統(tǒng)進化樹構建 從 PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php)中獲取擬南芥、水稻Oryzasativa的NAC序列,使用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,采用鄰近法(neighborjoining),1 000 次 Bootstrap 抽樣。

    1.2.4 桂花OfNAC轉錄因子表達分析 RNA 提取采用 UltraClean Polysaccharide and Phenol Plant RNA Purification Kit試劑盒(諾禾致源公司,中國天津),方法參照說明書。使用核酸分析儀(IMPLEN公司,德國)對RNA的純度與濃度進行檢測,并用質量分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。依據(jù)說明書使用 PrimeScript?RT Master Mix Perfect Real Time(TaKaRa,中國大連)試劑盒對桂花不同花開放時期的cDNA進行合成。利用Primer Premier 5.0對22個OfNAC基因進行定量特異性引物設計,桂花OfACT作為內參基因[20],引物序列如表 1 所示。熒光定量反應體系如下:SYBR Premix ExTaq10 μL,cDNA 2 μL,上游引物和下游引物 (10 μmol·L?1)各 8 μL,雙蒸水 (ddH2O)補足至 20 μL,每個樣品設置3次生物學重復。反應程序為:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃復性30 s,共40個循環(huán);然后以 95 ℃ 持續(xù) 5 s,60 ℃ 持續(xù) 1 min,95 ℃ 持續(xù) 15 s作為溶解曲線分析程序。循環(huán)閾值由 Light Cycler 480軟件自動計算。最后根據(jù)2???Ct法計算目的基因的相對表達量。

    表 1 桂花 OfNAC轉錄因子 RT-PCR 特異性引物Table 1 Specific primers for RT-PCR of OfNAC in O.fragrans

    2 結果分析

    2.1 桂花OfNAC轉錄因子鑒定及理化性質分析

    通過對桂花‘堰虹桂’轉錄組數(shù)據(jù)分析,并結合NCBI-Blast篩選,對其中22個桂花OfNAC基因進行分析。結果顯示:它們均含有NAC家族蛋白特有的 NAM保守功能域 (圖 1)。通過 ExPASy對22條桂花OfNAC轉錄因子進行理化性質分析(表2),結果表明:22條桂花OfNAC基因的氨基酸(OfNAC104~OfNAC91)長度為186~609個;蛋白質(OfNAC104~OfNAC17)相 對分子量為 21 498.77~68 408.12;等電點為 4.59~9.33,其中 OfNAC100-1、OfNAC73、OfNAC56、OfNAC72-1、OfNAC72-2、OfNAC29-1、OfNAC29-2、OfNAC32等8個蛋白質等電點大于7,偏堿性,其余14個OfNAC等電點小于7,偏酸性。OfNAC的不穩(wěn)定系數(shù)為29.27~52.83,OfNAC53、OfNAC73、OfNAC56、OfNAC92、OfNAC29-2等5個蛋白質不穩(wěn)定系數(shù)低于40,為穩(wěn)定蛋白質,其余17個不穩(wěn)定系數(shù)均高于40,為不穩(wěn)定蛋白質。脂溶性指數(shù)為53.37(OfNAC71)~77.70(OfNAC17-X2),總平均疏水值為?0.816~?0.530,蛋白質的平均疏水指數(shù)均小于0,表明OfNAC均為親水性蛋白質(表2)。

    圖 1 桂花 NAC 的 NAM 保守功能域分析Figure 1 NAM conserved functional domain about NAC

    表 2 桂花 OfNAC 蛋白質理化性質及二級結構分析Table 2 Physicochemical properties and secondary structure analysis of OfNAC of O.fragrans

    2.2 桂花OfNAC轉錄因子結構及亞細胞定位分析

    使用DNAMAN軟件對桂花OfNAC轉錄因子的氨基酸序列進行比對,結果顯示(圖2):22個OfNAC的氨基酸序列均具有保守的亞結構域(A~E)。對這5個亞結構域進行分析發(fā)現(xiàn):A區(qū)較為保守的氨基酸是甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、谷氨酸(E);B區(qū)較為保守的氨基酸是脯氨酸(P);C區(qū)較為保守的氨基酸是苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、甘氨酸(G);D區(qū)較為保守的氨基酸是甘氨酸(G)、賴氨酸(K)、色氨酸(W);E區(qū)沒有完全穩(wěn)定的氨基酸。各保守亞域的保守性由強到弱依次為C、A、D、B、E。對所有OfNAC的氨基酸序列進行保守基序分析發(fā)現(xiàn)(圖3):大多數(shù)OfNAC均含有較保守的元件,除OfNAC73只有2個保守元件(元件1、元件2)外,其余OfNAC均含有4個保守元件(元件1、元件3、元件4、元件5)。另外,22條OfNAC轉錄因子中元件7、元件9和元件10出現(xiàn)在一些OfNAC蛋白質的C端,且對應的序列親緣關系較近。桂花OfNAC蛋白質二級結構分析表明:OfNAC蛋白質的二級結構包括α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲4種結構,且不同結構占比從大到小依次表現(xiàn)為無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈、β-折疊(表3)。OfNAC32的無規(guī)則卷曲占比最高,為67.30%。此外,OfNAC73、OfNAC92、OfNAC29-2結構中α-螺旋占比均小于延伸鏈??缒そY構預測分析表明(圖4):OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9均在C端有1個跨膜結構。亞細胞定位預測分析表明:OfNAC53定位于內質網(wǎng),OfNAC50-X2和OfNAC50定位于葉綠體,其余OfNAC蛋白質均定位在細胞核中。

    圖 2 OfNAC 轉錄因子氨基酸序列比對Figure 2 Sequence alignment of OfNAC transcription factor

    圖 3 桂花OfNAC轉錄因子進化分析及保守基序分析Figure 3 Evolution analysis of 22 OfNAC transcription factors and analysis of conserved motif

    表 3 桂花 OfNAC 蛋白質理化性質及二級結構分析Table 3 Secondary structure analysis of OfNAC of O.fragrans

    圖 4 桂花 OfNAC 蛋白質跨膜結構預測Figure 4 Transmembrane structure prediction related to OfNAC protein

    2.3 桂花 OfNAC轉錄因子系統(tǒng)進化樹

    為了進一步研究OfNAC的進化關系,對桂花、擬南芥和水稻的NAC蛋白構建系統(tǒng)進化樹。結果表明:22個桂花OfNAC與擬南芥和水稻的NAC蛋白質共劃分為11個亞族(圖5),除a、b、c、e、h亞族外,其他亞族均有OfNAC分布。其中i亞族桂花NAC蛋白質較多,有8個OfNAC蛋白質。

    圖 5 桂花 OfNAC 與擬南芥、水稻的系統(tǒng)進化樹Figure 5 Phylogenetic tree of OfNAC, A.thaliana and O.sativa

    2.4 桂花OfNAC轉錄因子在不同花開放時期的表達分析

    為了研究OfNAC在桂花花開放進程中的表達模式,對其進行熒光定量表達分析(圖6)。OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相對表達量在鈴梗期(S4)出現(xiàn)表達高峰,在此之后相對表達量大幅度降低,其中OfNAC43只在鈴梗期(S4)相對表達量最高,其余時期相對表達量很低;OfNAC56從鈴梗期開始呈現(xiàn)上升趨勢,并在盛花期(S6)到達頂峰;OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22從起始期(S1)緩慢上升,在頂殼期 (S3)到達最高,隨后急劇下降;OfNAC29-2在圓珠期(S2)相對表達量達到最大,之后在鈴梗期(S4)相對表達達到最低。OfNAC在花開放不同階段的表達情況說明:OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2可能參與花開放的調控,其中又以OfNAC43和OfNAC29-2關聯(lián)最為緊密。

    圖 6 22個 OfNAC 基因在不同花開放時期的表達結果Figure 6 Expression results of 22 OfNAC genes in different flower opening periods

    OfNAC50-X2、OfNAC50、OfNAC17-X2整體呈現(xiàn)上升趨勢,并在初開期(S5)達到最高;OfNAC100-1、OfNAC92、OfNAC72-1、OfNAC91、OfNTM1-9、OfNAC53在起始期(S1)表達量較高,整體呈下降趨勢;OfNAC104、OfNAC32、OfNAC2、OfNAC17、OfNAC72-2均呈現(xiàn)先下調后上升的表達趨勢,到盛花期(S6)相對表達量較高。這說明,這些基因成員可能不參與桂花花開放的調控。

    3 討論

    NAC轉錄因子最初在矮牽牛Petuniahybrida中發(fā)現(xiàn)[21]。在模式植物擬南芥、水稻以及園藝作物中的研究較多。在擬南芥、水稻、黃瓜Cucumissativus、紫花苜蓿Medicagosativa中分別有151、117、91、113個NAC基因被鑒定[22?24]。目前關于桂花OfNAC轉錄因子的報道較少。通過桂花OfNAC轉錄因子的鑒定與分析,可為進一步了解桂花OfNAC的生物學功能及其在花開放過程中的作用奠定基礎。

    本研究通過轉錄組測序鑒定出22條開放閱讀框完整的OfNAC轉錄因子,對它們進行跨膜結構預測發(fā)現(xiàn):OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9這5個轉錄因子均在C端有1個跨膜結構,推測它們可能是NAC膜結合轉錄因子。大多數(shù)OfNAC蛋白質預測定位在細胞核中的可能性較高,因此推測,OfNAC轉錄因子可能大多依舊在細胞核內發(fā)揮功能。目前,已經(jīng)在模式植物中發(fā)現(xiàn)NAC膜結合轉錄因子,如擬南芥和水稻NAC基因組中已發(fā)現(xiàn)分別有18和6個膜結合NAC轉錄因子[25?26],其中擬南芥膜結合轉錄因子NTM1調節(jié)細胞分裂素信號傳導而參與細胞分裂;NTL8調節(jié)擬南芥開花時間,過表達轉基因植株出現(xiàn)晚花現(xiàn)象;ANAC089被確定為另一個膜結合轉錄因子,也有調控擬南芥開花時間的功能[27?28]。由此推測,桂花OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9可能也具有調控開花時間的功能。

    桂花22個OfNAC與擬南芥和水稻NAC蛋白質共同劃分為11個亞族。根據(jù)親緣關系推測相關OfNAC基因的功能,如OfNAC100-1、OfNAC100-2與擬南芥At5G6140.1、At5G7680.1、At5G39610.1、At3G29035.1親緣性較高,其中At5G39610.1(ANAC92/ATNAC2)存在于部分或完全開放的花的花器官中,且參與葉和花的衰老過程[29]。在月季中,RhNAC100是At5G39610.1(ANAC92/ATNAC2)的同源基因,乙烯通過微調microRNA164-RhNAC100模塊來調節(jié)細胞的擴張從而影響月季花瓣的擴展[30],OfNAC100-1和OfNAC100-2與擬南芥At5G39610.1親緣關系較近,所以推測OfNAC100-1與OfNAC100-2可能有調節(jié)花瓣擴展的相關功能。OfNTM1-9與At1G33060.1同源性較高,且At1G33060.1是膜結合轉錄因子,在擬南芥各個器官均有表達,影響葉片衰老[25],推測OfNTM1-9可能作為NAC膜結合轉錄因子參與細胞衰老。

    花開放的主要原因是花瓣細胞的擴展[11?13],對OfNAC基因在桂花花開放時期的熒光定量表達分析表明:OfNAC在桂花花開放過程中發(fā)揮重要作用,且不同的OfNAC在此過程中表達模式有差異。OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22在頂殼期相對表達到達最大。羅云等[31]發(fā)現(xiàn):OfEXPA2和OfEXLA1在桂花花開放的頂殼期相對表達急劇增加并到達頂峰,推測此時期的高豐度表達是后續(xù)花開放的基礎。OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22與OfEXPA2和OfEXLA1表達模式相似,推測它們參與花開放進程。OfEXPA4在花芽萌發(fā)期至圓珠期表達量較低,而頂殼期開始急劇上升,鈴梗期表達量達到最大。羅云等[31]推測:OfEXPA4是參與花瓣擴展的關鍵基因,OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相對表達量也在鈴梗期出現(xiàn)峰值,推測它們亦作為關鍵基因參與桂花花瓣擴展。對月季的研究發(fā)現(xiàn):RhNAC2和RhEXPA4參與月季花瓣細胞擴展,且RhEXPA4的表達可能受到RhNAC2的調控[32],擬南芥中NAC25和NAC1L被確定是EXPA2(EXPANSIN2)的上游調控因子[33]。以此推測,NAC轉錄因子可能與EXP的啟動子結合,是EXP的上游調控因子,則OfNAC29-2在圓珠期相對表達最大,可能是作為OfEXPA2和OfEXLA1調控因子調節(jié)OfEXP影響花瓣細胞擴張從而為后續(xù)花瓣展開奠定基礎,所以OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2 可能是參與桂花花開放的關鍵基因。由于OfNAC43、OfNAC29-2相對表達差異明顯,推測它們與花開放關系更為緊密,但這些關鍵基因在桂花開花中的具體作用還需要進一步研究。

    4 結論

    本研究從桂花品種‘堰虹桂’轉錄組數(shù)據(jù)中篩選得到22條OfNAC序列,生物信息學分析結果表明:22條OfNAC轉錄因子氨基酸序列含有5個保守的亞結構域(A~E),其保守性由強到弱依次為C、A、D、B、E;亞細胞定位及跨膜結構預測表明:OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9是膜結合轉錄因子,且大多數(shù)OfNAC定位在細胞核。實時熒光定量PCR分析表明:在桂花花開放進程中,22個OfNAC基因表達模式不同,其中OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相對表達量在鈴梗期(S4)達到頂峰,在此之后相對表達降低。OfNAC43在鈴梗期驟然升高,并且在此時期相對表達最大;OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22從起始期呈緩慢上升趨勢,在頂殼期到達最高,隨后整體呈現(xiàn)下降趨勢;OfNAC29-2在圓珠期相對表達量陡然上升,在鈴梗期相對表達最低,推測OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2等成員極有可能參與調控桂花的花開放。

    猜你喜歡
    擬南芥桂花花瓣
    擬南芥:活得粗糙,才讓我有了上太空的資格
    桂花
    做桂花糕
    小讀者(2021年2期)2021-03-29 05:03:12
    桂花蒸
    打桂花
    尿黑酸對擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的影響
    郁金香花瓣
    花瓣報
    兩種LED光源作為擬南芥生長光源的應用探究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應機制探究
    国产成人精品久久二区二区91| 中文字幕高清在线视频| 欧美日韩一级在线毛片| 无人区码免费观看不卡 | 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 在线av久久热| 午夜91福利影院| 国产亚洲av高清不卡| 国产一区有黄有色的免费视频| 色94色欧美一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 色94色欧美一区二区| 91av网站免费观看| 777米奇影视久久| 午夜福利影视在线免费观看| 搡老岳熟女国产| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 成人三级做爰电影| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 成人亚洲精品一区在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 视频区图区小说| 看免费av毛片| 久久久久久免费高清国产稀缺| kizo精华| 丝袜人妻中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产精品久久久人人做人人爽| cao死你这个sao货| 两性夫妻黄色片| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美精品av麻豆av| 日韩一区二区三区影片| www.999成人在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品av麻豆狂野| 不卡一级毛片| 性高湖久久久久久久久免费观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 老司机亚洲免费影院| 一个人免费看片子| 电影成人av| 国产精品免费大片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久天堂一区二区三区四区| 久9热在线精品视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 1024香蕉在线观看| 成年人黄色毛片网站| 亚洲情色 制服丝袜| 成人特级黄色片久久久久久久 | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产亚洲精品一区二区www | 18禁观看日本| 考比视频在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产又爽黄色视频| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品 欧美亚洲| 一级黄色大片毛片| 久久久久精品人妻al黑| 桃花免费在线播放| 水蜜桃什么品种好| 精品少妇黑人巨大在线播放| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲 欧美一区二区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精品美女久久av网站| 一区在线观看完整版| 怎么达到女性高潮| 十八禁高潮呻吟视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 午夜成年电影在线免费观看| 另类精品久久| 免费高清在线观看日韩| 一级片'在线观看视频| 老司机在亚洲福利影院| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜91福利影院| 国产日韩欧美在线精品| 高清毛片免费观看视频网站 | 后天国语完整版免费观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美日韩黄片免| 啦啦啦 在线观看视频| 国产成人av教育| 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜福利视频在线观看免费| 最新的欧美精品一区二区| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 捣出白浆h1v1| av又黄又爽大尺度在线免费看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 日本五十路高清| 男女免费视频国产| 淫妇啪啪啪对白视频| 18禁观看日本| 夜夜爽天天搞| 黄色毛片三级朝国网站| 精品一区二区三卡| 视频在线观看一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费黄频网站在线观看国产| 一区二区三区精品91| 精品一区二区三区av网在线观看 | 青草久久国产| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲精品一二三| 欧美成狂野欧美在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品在线观看二区| 久久精品91无色码中文字幕| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品电影一区二区三区 | 香蕉丝袜av| 2018国产大陆天天弄谢| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 99re6热这里在线精品视频| 日韩有码中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av欧美777| 最新的欧美精品一区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 男女无遮挡免费网站观看| 午夜福利在线观看吧| 青青草视频在线视频观看| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黄色毛片三级朝国网站| 成年动漫av网址| 在线观看免费日韩欧美大片| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| aaaaa片日本免费| 老司机亚洲免费影院| 亚洲成人国产一区在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品熟女久久久久浪| 国产一卡二卡三卡精品| 女警被强在线播放| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲av片天天在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 搡老乐熟女国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 最近最新中文字幕大全免费视频| 日本av手机在线免费观看| 国产在线一区二区三区精| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 色视频在线一区二区三区| 亚洲少妇的诱惑av| 免费人妻精品一区二区三区视频| 成人永久免费在线观看视频 | 国产1区2区3区精品| 少妇精品久久久久久久| 大香蕉久久成人网| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲av美国av| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 亚洲精华国产精华精| 国产99久久九九免费精品| 国产野战对白在线观看| 制服诱惑二区| 激情在线观看视频在线高清 | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 美女国产高潮福利片在线看| 90打野战视频偷拍视频| 成人影院久久| 欧美av亚洲av综合av国产av| 99香蕉大伊视频| 国产精品熟女久久久久浪| 深夜精品福利| 美女扒开内裤让男人捅视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| av电影中文网址| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 午夜精品久久久久久毛片777| 国产在视频线精品| 在线天堂中文资源库| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲熟女毛片儿| 国产av精品麻豆| 搡老乐熟女国产| 国产男靠女视频免费网站| 丝袜人妻中文字幕| 美国免费a级毛片| 1024香蕉在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 涩涩av久久男人的天堂| 日本av免费视频播放| 99国产精品一区二区三区| 高清视频免费观看一区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美亚洲日本最大视频资源| 电影成人av| 热re99久久国产66热| 人妻 亚洲 视频| bbb黄色大片| 欧美日韩av久久| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 999久久久国产精品视频| 久久亚洲真实| 欧美性长视频在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 搡老乐熟女国产| 久久久国产欧美日韩av| 一区二区av电影网| 999久久久精品免费观看国产| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 热re99久久精品国产66热6| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产人伦9x9x在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 99香蕉大伊视频| 九色亚洲精品在线播放| 最近最新中文字幕大全免费视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产不卡一卡二| 在线观看免费午夜福利视频| 少妇 在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 看免费av毛片| 人妻一区二区av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 国产精品成人在线| 一级黄色大片毛片| 交换朋友夫妻互换小说| 美国免费a级毛片| www.999成人在线观看| 国产男女内射视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 操出白浆在线播放| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产成人av激情在线播放| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 首页视频小说图片口味搜索| 97在线人人人人妻| 国产国语露脸激情在线看| 久久国产精品影院| 国产成人精品久久二区二区91| 热re99久久国产66热| 免费在线观看完整版高清| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 18禁观看日本| 99精品久久久久人妻精品| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 无限看片的www在线观看| 捣出白浆h1v1| 黄色怎么调成土黄色| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产男女内射视频| 日韩视频在线欧美| 老司机午夜福利在线观看视频 | 久久精品亚洲av国产电影网| 女同久久另类99精品国产91| av超薄肉色丝袜交足视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 99re6热这里在线精品视频| 成人18禁在线播放| 精品人妻在线不人妻| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 999久久久精品免费观看国产| 夜夜爽天天搞| 9热在线视频观看99| 国产av精品麻豆| 中文字幕av电影在线播放| 国产不卡av网站在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 丁香六月天网| 制服诱惑二区| 蜜桃国产av成人99| 国产黄色免费在线视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产伦理片在线播放av一区| 在线播放国产精品三级| 国产高清激情床上av| 首页视频小说图片口味搜索| 免费黄频网站在线观看国产| 首页视频小说图片口味搜索| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美黄色淫秽网站| 新久久久久国产一级毛片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 不卡一级毛片| 免费观看a级毛片全部| 日本黄色视频三级网站网址 | www.熟女人妻精品国产| 啦啦啦免费观看视频1| 最新在线观看一区二区三区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 人妻久久中文字幕网| 久久国产精品影院| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产97色在线日韩免费| 欧美日韩av久久| 国产高清激情床上av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 麻豆av在线久日| 国产精品 欧美亚洲| 涩涩av久久男人的天堂| 久久久久久久精品吃奶| 久久久久视频综合| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 成年人免费黄色播放视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲专区国产一区二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美激情久久久久久爽电影 | 黄片播放在线免费| 久久久久精品人妻al黑| 一级毛片精品| 国产精品.久久久| xxxhd国产人妻xxx| 天堂动漫精品| 免费在线观看日本一区| 五月开心婷婷网| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久ye,这里只有精品| 久久久欧美国产精品| 精品欧美一区二区三区在线| 久久久国产欧美日韩av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 丁香欧美五月| 亚洲avbb在线观看| 在线永久观看黄色视频| 欧美大码av| 1024香蕉在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲久久久国产精品| 两个人看的免费小视频| 欧美日本中文国产一区发布| 黄色毛片三级朝国网站| 成人免费观看视频高清| 99国产精品99久久久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品卡一卡二卡四卡免费| 视频区欧美日本亚洲| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 一级毛片精品| 天天添夜夜摸| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲黑人精品在线| 亚洲专区国产一区二区| 中文欧美无线码| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲天堂av无毛| 天堂俺去俺来也www色官网| 狠狠狠狠99中文字幕| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 免费观看av网站的网址| 久久久久网色| 亚洲国产欧美一区二区综合| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产精品偷伦视频观看了| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩大码丰满熟妇| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 极品人妻少妇av视频| 新久久久久国产一级毛片| 国产97色在线日韩免费| 成年动漫av网址| 一级毛片电影观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 中文字幕高清在线视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 下体分泌物呈黄色| 国产黄频视频在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 波多野结衣一区麻豆| 少妇粗大呻吟视频| 国产麻豆69| 一个人免费看片子| 国产精品欧美亚洲77777| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 色播在线永久视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美人与性动交α欧美软件| a级毛片在线看网站| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲熟女精品中文字幕| 91字幕亚洲| 性少妇av在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美黄色片欧美黄色片| 窝窝影院91人妻| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲av成人一区二区三| 中文字幕人妻丝袜制服| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 成人特级黄色片久久久久久久 | 久久国产精品影院| 久久久国产成人免费| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 免费不卡黄色视频| 成年动漫av网址| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 手机成人av网站| 中国美女看黄片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费观看a级毛片全部| 老熟女久久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 中文字幕人妻熟女乱码| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产真人三级小视频在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 1024香蕉在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 窝窝影院91人妻| 久久中文字幕人妻熟女| 免费日韩欧美在线观看| 黄片大片在线免费观看| 999久久久国产精品视频| 国产97色在线日韩免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 一本久久精品| av网站免费在线观看视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产精品久久久av美女十八| 久久影院123| 国产欧美亚洲国产| 高清欧美精品videossex| 色精品久久人妻99蜜桃| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产单亲对白刺激| a级片在线免费高清观看视频| 黄色毛片三级朝国网站| 国产免费福利视频在线观看| 九色亚洲精品在线播放| av福利片在线| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 国产三级黄色录像| 岛国在线观看网站| 欧美日韩视频精品一区| 免费看a级黄色片| 多毛熟女@视频| 日本黄色日本黄色录像| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 成年版毛片免费区| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 搡老乐熟女国产| 视频区欧美日本亚洲| 成年人午夜在线观看视频| 超色免费av| 日韩欧美国产一区二区入口| 高清av免费在线| 午夜福利,免费看| 亚洲国产欧美网| 69av精品久久久久久 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产在视频线精品| 超色免费av| 国产在线一区二区三区精| 欧美中文综合在线视频| 久久av网站| 亚洲成人手机| av网站免费在线观看视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 操美女的视频在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲中文日韩欧美视频| a级毛片在线看网站| 日韩免费av在线播放| 亚洲综合色网址| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品电影一区二区三区 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 十八禁网站网址无遮挡| 无限看片的www在线观看| 十八禁人妻一区二区| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 99九九在线精品视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 中文字幕制服av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产淫语在线视频| 国产成人av激情在线播放| 午夜福利免费观看在线| av免费在线观看网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| www.自偷自拍.com| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品国产高清国产av | 我的亚洲天堂| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产亚洲av高清不卡| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 丁香六月欧美| 欧美在线一区亚洲| 91字幕亚洲| 黑人猛操日本美女一级片| 五月开心婷婷网| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 无人区码免费观看不卡 | 成人精品一区二区免费| 久久精品91无色码中文字幕| 午夜免费成人在线视频| 最新美女视频免费是黄的| 国产男女超爽视频在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 无人区码免费观看不卡 | 国产成人精品久久二区二区免费| 中国美女看黄片| 国产男靠女视频免费网站| 久久人妻av系列| 国产亚洲精品久久久久5区| 蜜桃国产av成人99| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | kizo精华| 美国免费a级毛片| 两性夫妻黄色片| 天天影视国产精品| 一级毛片精品| 亚洲精品自拍成人| 国产野战对白在线观看| 色视频在线一区二区三区| 在线看a的网站| 中文字幕制服av| 成人18禁在线播放| 国产精品av久久久久免费| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 久久热在线av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品 欧美亚洲| 成在线人永久免费视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久久久视频综合| 国产在线免费精品| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品国产高清国产av | 一本久久精品| 国产熟女午夜一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 丰满少妇做爰视频| 男人操女人黄网站| h视频一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 成年人黄色毛片网站| avwww免费| 午夜91福利影院| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av片天天在线观看| 久久九九热精品免费| 欧美在线黄色| 久久国产亚洲av麻豆专区| 超色免费av| 精品一区二区三卡| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久九九热精品免费| 精品一品国产午夜福利视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产淫语在线视频| 咕卡用的链子| 国产精品成人在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 成人精品一区二区免费| 成人手机av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 色综合婷婷激情| 国产av又大| 在线永久观看黄色视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美日韩福利视频一区二区| 热99久久久久精品小说推荐| 国产精品熟女久久久久浪|