七味白術(shù)散總苷含量測定方法的探索與優(yōu)化

唐 圓，劉海會，黃莉莉，譚周進(jìn)，謝果珍

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

苷類化合物是中藥的一類重要成分，有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、提高免疫等藥理作用[1-2]，因此，研究者們常將總苷作為中藥復(fù)方的有效部分進(jìn)行提取分離及藥理藥效研究?？傑盏暮繙y定是評價提取工藝及制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容。然而，苷類化合物由糖或糖的衍生物與苷元通過糖苷鍵連接而成，苷元的種類繁多，所連接糖基的類型及數(shù)量各異，因此苷的性質(zhì)也各有不同，導(dǎo)致中藥復(fù)方中總苷含量的測定較困難[3]?，F(xiàn)有的測定方法多著眼于苷元部分，先選定某一種或幾種苷為代表，通過紫外分光光度法或色譜法檢測，再與標(biāo)準(zhǔn)品比較，計算含量[4-5]。但此法存在以下不足：（1）僅以一種或少數(shù)幾種苷類成分為代表，難以全面反映中藥復(fù)方總苷的含量；（2）方法的普適性較差。有些苷類成分如人參皂苷的紫外響應(yīng)較弱，在復(fù)方中存在其他苷類成分時用紫外分光光度法或液相色譜法難以同時檢出[6]；（3）某些標(biāo)準(zhǔn)品價格高、不易得。因此，筆者以七味白術(shù)散為例，結(jié)合苷類化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，從苷的糖苷鍵及糖基著手，用酸解法使苷元與糖、糖與糖之間的糖苷鍵斷裂，分離出苷元與還原糖，應(yīng)用3,5-二硝基水楊酸法測定總苷酸解前后還原糖的含量，再以二者的差值表征七味白術(shù)散總苷的含量，期望為中藥復(fù)方總苷的含量測定提供新思路、新方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗藥材有土炒白術(shù)（浙江，批號2018062902）、人參（吉林，批號2018091891）、木香（云南，批號2018081401）、甘草（寧夏，批號2018102004）、廣藿香（廣東，批號2018041102）、葛根（湖南，批號2018080601）、茯苓（云南，批號2018121301），均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院。

主要試劑有3,5-二硝基水楊酸、苯酚、石油醚、正丁醇和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉和四水合酒石酸鉀鈉（西隴科學(xué)股份有限公司，XK1320100153），無水亞硫酸鈉和無水乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，20190803）。乙酸乙酯和硫酸（湖南匯鴻試劑有限公司）。

主要儀器設(shè)備有UV1901PCS型紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、電子天平（Balance）、循環(huán)水式真空泵（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）、202-2AB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、都市主婦全能小鋼磨（永康市鉑歐五金制品有限公司）、HA-600三用恒溫水箱（神科儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 七味白術(shù)散總苷的制備 將各飲片烘干打粉，過60目篩，按全方劑量的1/5（人參1.5 g、土炒白術(shù)3.0 g、茯苓3.0 g、葛根3.0 g、木香1.2 g、甘草0.6 g、藿香3.0 g）稱取各味藥粉末，加入10倍量沸水煎煮2次，每次30 min，將2次濾液合并，濃縮至40 mL；冷卻后加入無水乙醇使乙醇的終濃度為75%，4℃醇沉過夜，將乙醇提取液濃縮至20 mL；用石油醚（10、5、5 mL）脫脂3次，水層依次用乙酸乙酯（15、10、10 mL）、水飽和的正丁醇（15、10、10 mL）各萃取3次；合并乙酸乙酯層及正丁醇層溶液，蒸干溶劑，即得七味白術(shù)散總苷。將所得的七味白術(shù)散總苷配成濃度為0.009 1 g/mL的樣品溶液備用。

1.2.2 試劑制備 （1）DNS試劑制備：稱取酒石酸鉀鈉45.5 g溶于250 mL水中，依次加入3,5-二硝基水楊酸1.625 0 g、NaOH 10.0 g，超聲使其溶解；再加入苯酚1.25 g，無水Na2SO31.25 g，攪拌溶解；然后定容至500 mL，搖勻后儲存在棕色瓶中，避光放置7 d后使用。（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.5 g，加適量蒸餾水溶解后定容至500 mL，濃度為1 mg/mL。

1.2.3 檢測條件的優(yōu)化 取1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入DNS試劑 5 mL，搖勻后沸水浴5 min，取出自然冷卻后加蒸餾水定容至15 mL，搖勻后以蒸餾水為空白進(jìn)行全波長掃描，得到最優(yōu)檢測波長。通過單因素試驗分別考察DNS用量（1、2、3、4、5 mL）、顯色時間（9、11、13、15、17 min）、顯色溫度（60、70、80、90、100℃）對含量測定的影響。

1.2.4 酸解條件的優(yōu)化 取1 mL樣品溶液，根據(jù)1.2.3得到優(yōu)化的顯色條件，通過單因素考察硫酸濃度（2、3、4、5、6 mol/L）、酸 解 溫 度（60、70、80、90、100℃）、酸解時間（60、70、80、90、100 min）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）等酸解條件對總苷酸解的影響。

1.2.5 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗。取同一組1.2.1中總苷溶液1 mL按照優(yōu)化后的條件，連續(xù)測定5次吸光度，分別考察檢測方法及酸解方法的精密度。（2）重復(fù)性試驗。取同一總苷溶液1 mL按照優(yōu)化后的條件，測定5個樣本的吸光度，考察檢測方法及酸解方法的重復(fù)性。（3）穩(wěn)定性試驗。取1 mL總苷溶液按照優(yōu)化后的條件測定吸光度，顯色反應(yīng)結(jié)束后檢測0、30、60、90、120 min 的吸光度，考察檢測方法及酸解方法的穩(wěn)定性。（4）回收率試驗。取同一總苷溶液1 mL，分別加入1 mL濃度分別為0.25、0.5、1.0 g/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的檢測方法對回收率進(jìn)行考察。取同一總苷溶液1 mL分別加入1 mL濃度分別為0.3、0.4、0.5 g/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的酸解方法對回收率進(jìn)行考察。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 最佳檢測波長 通過全波長掃描，確定最大吸收波長為540 nm。

2.1.2 最優(yōu)顯色劑用量 由圖1可知，總苷樣品量為1 mL時，DNS用量在1～5 mL范圍內(nèi)，吸光度隨著DNS用量的增加而增大，DNS用量為5 mL時吸光度到最大值，大于5 mL后吸光度基本沒有變化。因此，確定DNS的最佳用量為5 mL。

圖1 DNS用量對吸光度的影響

2.1.3 最優(yōu)顯色時間 先在3～17 min范圍內(nèi)以2 min為梯度進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在3～13 min 內(nèi)吸光度逐漸增加，沒有到達(dá)峰值，故在9～17 min范圍內(nèi)再進(jìn)行比較。由圖2可知，顯色時間在13 min時吸光度達(dá)到最大值，再延長顯色時間吸光度逐漸下降。因此，確定最佳顯色時間為13 min。

圖2 顯色時間對吸光度的影響

2.1.4 最優(yōu)顯色溫度 由圖3可知，溫度在60～90℃范圍內(nèi)，吸光度隨著溫度的增加而增大，到達(dá)90℃后再增加溫度，吸光度反而呈下降趨勢。因此，確定最佳顯色溫度為90℃。

圖3 顯色溫度對吸光度的影響

綜合以上結(jié)果，DNS測定七味白術(shù)散總苷含量的最優(yōu)條件為：檢測波長540 nm，顯色劑用量5 mL、顯色時間13 min、顯色溫度90 ℃。

2.2 酸解條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 最優(yōu)硫酸濃度 酸解時硫酸濃度太高會碳化有機(jī)物，試驗設(shè)定的考察范圍為2～6 mol/L，結(jié)果如圖4所示，酸濃度在3 mol/L時吸光度最大，當(dāng)超過此酸度后吸光度呈現(xiàn)下降趨勢，并且在高酸度條件下，試管中出現(xiàn)碳化現(xiàn)象。因此，確定試驗最佳酸濃度為3 mol/L。

圖4 酸濃度對吸光度的影響

2.2.2 最佳酸解溫度 由圖5可知，酸解溫度在60～90℃時，吸光度隨時間增加而增加，到達(dá)90℃后再增加溫度，吸光度反而下降。因此，確定最佳酸解溫度為90℃。

圖5 酸解溫度對吸光度的影響

2.2.3 最優(yōu)酸解時間 酸解時間關(guān)系到酸解是否完全，時間太短酸解不完全。由圖6可知，酸解80 min時吸光度最大。因此，最佳酸解時間為80 min。

圖6 酸解時間對吸光度的影響

2.2.4 最優(yōu)料液比 由圖7可知，七味白術(shù)散總苷溶液與3 mol/L的硫酸的比例為1∶2時吸光度最大，料液比小于1∶2后吸光度逐漸減小。因此，最優(yōu)七味白術(shù)散總苷溶液與3 mol/L的硫酸的比例為1∶2。

圖7 料液比對吸光度的影響

綜合以上結(jié)果，得到七味白術(shù)散總苷酸解的最優(yōu)條件為：酸濃度3 mol/L、酸解溫度90℃、酸解時間80 min，料液比1∶2。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 檢測條件方法學(xué)考察 由表1可知，檢測條件精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.45%、1.43%和1.04%，說明優(yōu)化的DNS法穩(wěn)定、可靠。由表2可知，樣品的加標(biāo)回收率在98.52%～101.78%之間，RSD分別為0.74%、0.16%、0.73%，說明該方法的回收性良好，準(zhǔn)確度良好。

表1 檢測條件的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性

表2 檢測條件的加標(biāo)回收率

2.3.2 酸解條件方法學(xué)考察 由表3可知，酸解條件的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.11%、0.38%、0.84%，說明優(yōu)化的酸解方法穩(wěn)定、可靠。由表4可知，樣品的加標(biāo)回收率在98.95%～101.23%之間，RSD分別為0.32%、0.79%、1.14%，說明該方法的回收性和準(zhǔn)確度良好。

表3 酸解條件的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性

表4 酸解條件的加標(biāo)回收率

3 結(jié) 論

苷類化合物的結(jié)構(gòu)中包括了苷元、糖苷鍵及糖基部分，苷元的性質(zhì)差異較大，而糖苷鍵酸解后得到的還原糖卻容易檢測[7]。由此推及，在酸解完全的情況下，所測得的總還原糖的量與苷的含量應(yīng)呈正相關(guān)關(guān)系，考慮到中藥復(fù)方總苷提取物可能含有還原糖的存在，故分別測定同一總苷溶液酸解前后的還原糖含量，以二者的差值表征總苷含量?；诖耍撗芯刻岢鲇盟峤馇昂筮€原糖的差值代表中藥復(fù)方總苷含量的思路，以七味白術(shù)散為例，選用DNS法測定其總苷含量。

七味白術(shù)散出自《小兒藥證直訣》，由人參、白茯苓、炒白術(shù)、藿香、木香、甘草和葛根七味藥組成[8]，內(nèi)含人參皂苷、甘草酸、甘草苷、芒柄花苷、葛根素、大豆苷、染料木苷、金絲桃苷等苷類化合物[9]，主要為黃酮苷和皂苷，其中，葛根素為黃酮碳苷[10]。黃酮碳苷結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，需在強(qiáng)酸、高溫或高壓條件下酸解。若黃酮碳苷在某一條件下可酸解，其余的苷亦可在相同條件下順利酸解。因此，該研究對七味白術(shù)散總苷的酸解條件進(jìn)行考察，在特定條件下吸光度達(dá)到最大時視為酸解完全，得到最優(yōu)酸解條件為：硫酸濃度3 mol/L、酸解溫度90℃、酸解時間80 min、料液比1∶2。

蒽酮硫酸法及苯酚硫酸法雖可用于測定糖含量，但其酸解時間較短，難以將中藥復(fù)方總苷酸解完全，故該研究選用DNS法進(jìn)行測定。DNS法是常見的糖含量測定方法，主要用于測定還原性糖。其原理是還原性糖將3,5-二硝基水楊酸結(jié)構(gòu)中的硝基還原為氨基，還原后的產(chǎn)物在堿性環(huán)境中呈現(xiàn)橘紅色，可溶于堿性溶液。因此，可以用比色法測定還原性糖的含量[11]。該研究對DNS法測定七味白術(shù)散總苷的條件及方法學(xué)進(jìn)行了考察，得到最優(yōu)的檢測條件為：檢測波長540 nm，顯色劑用量5 mL、顯色時間13 min、顯色溫度90℃。該法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率良好，且操作簡單、反應(yīng)迅速、無須貴重的儀器及標(biāo)準(zhǔn)品，適用于中藥復(fù)方總苷的含量測定。