超聲輔助酶法提取金銀花多糖的工藝優(yōu)化

呂 欣，譚春玲，麥名娜，林容芳,張美霞

（重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 402160）

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb）的干燥花蕾或初開的花，其藥用歷史悠久，是清熱解毒、涼散風(fēng)熱的良藥[1]，一般用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱[2]和降血脂、降血糖[3]等。金銀花多糖是金銀花的主要活性成分之一[4]。近代研究表明，植物多糖具有抗腫瘤、降血糖、抗補(bǔ)體、抗氧化性[5-9]等生理活性，可應(yīng)用于化妝品、保健品[10]等領(lǐng)域，具有一定的開發(fā)價(jià)值。常用的金銀花多糖提取方法有水提法、超聲提取法、水提醇沉法等，其多糖得率較低。周小楠等[11]采用酶法提取金銀花多糖可顯著提高多糖得率，趙鵬等[12]采用超聲法提取金銀花多糖，與傳統(tǒng)水提法相比，超聲提取時(shí)間可縮短2/3左右。目前，未見超聲法與酶法聯(lián)用提取金銀花多糖的相關(guān)報(bào)道。因此，筆者以金銀花為原材料，采用超聲波輔助酶法提取金銀花多糖，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析法對(duì)多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，探索超聲輔助酶法提取金銀花多糖的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試金銀花來自康美藥業(yè)股份有限公司。主要試劑有纖維素酶（10萬U/g，和氏璧生物科技有限公司），葡萄糖、無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），濃硫酸、鹽酸（重慶川東化工有限公司）。主要儀器設(shè)備有752 紫外可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、XMTD-204 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）、SB-5200DTDN 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、TGL-21 高速冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）、DS-T300 高速多功能粉碎機(jī)（上海頂帥電器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金銀花多糖的提取方法 對(duì)周小楠等[11]提取方法進(jìn)行改良。稱取約10 g金銀花粉末，按照要求的單因素條件進(jìn)行超聲提取，用8層紗布過濾，調(diào)節(jié)提取液pH值，酶解溫度50℃，加入纖維素酶酶解1 h后100℃高溫滅活10 min，4 000 r/min條件下離心20 min進(jìn)行分離，棄去沉淀，用鹽酸法[13]除蛋白，濃縮至原液體積的約1/10后加入4倍無水乙醇醇沉一夜，有絮狀物析出，抽濾，濾餅依次用乙醇、丙酮、乙醚淋洗，干燥得金銀花多糖。

1.2.2 金銀花多糖含量的測(cè)定 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。采用苯酚-硫酸法[14]測(cè)定多糖的含量。稱取干燥至衡重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g至100 mL容量瓶并用蒸餾水定容，制得1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；取上述配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL至100 mL容量瓶；定容至刻度，混勻，制得濃度分別0、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。從上述已配制各濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液中分別取出2 mL于試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，再迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，室溫靜置40 min，在490 nm下測(cè)定溶液的吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。獲得苯酚-硫酸法測(cè)定多糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.007 3X-0.019 7，R2=0.992 7。（2）樣品多糖含量的測(cè)定。按苯酚-硫酸法[14]稱取0.01 g樣品多糖于200 mL容量瓶中，定容至刻度，吸取2 mL溶液于試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，再迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，室溫靜置40 min，在490 nm下測(cè)定溶液的吸光度值。多糖得率按下列公式計(jì)算。

式中，W為金銀花多糖的得率（%）；C為從回歸曲線中計(jì)算得出的糖濃度（mg/mL）；V為定容體積（mL）；M1為金銀花粗多糖質(zhì)量（mg）；M2為金銀花原料質(zhì)量（干花粉末，mg）；M3為配置金銀花粗多糖溶液時(shí)稱取的質(zhì)量（mg）。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 精確稱取經(jīng)粉碎過的金銀花粉末10.0 g，參考周小楠等[11]及胡琴漢等[15]研究結(jié)果，設(shè)定酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間為1 h固定不變，以超聲時(shí)間60 min、超聲溫度50℃、超聲功率200 W、料液比1∶20（g/mL）、酶添加量1.5%、酶解pH值5為試驗(yàn)常規(guī)量，分別考察超聲時(shí)間（20、40、60、80、100 min）、超聲溫度（40、50、60、70、80℃）、超聲功率（40、80、120、160、200 W）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL）、酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解pH值（3、4、5、6、7、8）對(duì)金銀花多糖得率的影響，每個(gè)處理設(shè)3次平行試驗(yàn)，從而確定上述6個(gè)因素的最佳參數(shù)。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，分別選取酶用量（X1）、超聲溫度（X2）、料液比（X3）這3個(gè)對(duì)金銀花多糖得率影響較為顯著的因素為自變量，以金銀花多糖得率為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行三因素三水平[16-17]試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表 1 響應(yīng)面分析法的因素及水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)方差分析（方差同質(zhì)性檢驗(yàn)），用Excel 2010軟件作圖，采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)金銀花多糖得率的影響 如圖1所示，多糖得率隨著料液比的增加而明顯增高，這是因?yàn)殡S著水溶劑的增多，多糖可以充分溶出；在料液比為1∶50時(shí)，多糖得率最大；而料液比為1∶60時(shí)，多糖得率有下降趨勢(shì)，這是由于水溶劑的增多，可能導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致溶出的多糖迅速在水中溶解[18]，且料液比過大可導(dǎo)致后期處理的損失增多，從而降低了多糖的得率。因此，確定最佳料液比為1∶50（g/mL）。

圖1 不同料液比處理金銀花多糖的得率

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)金銀花多糖得率的影響 如圖2所示，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率呈上升趨勢(shì)，超聲時(shí)間為60 min時(shí)，多糖得率最大，超過60 min后，多糖得率降低，可能是因?yàn)槌暡ň哂休^強(qiáng)的剪切作用[19]，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)破壞多糖的分子結(jié)構(gòu)[20]，促使多糖在外力作用下發(fā)生水解反應(yīng)，從而降低多糖含量，影響得率。因此，確定最佳超聲時(shí)間為60 min。

圖2 不同超聲時(shí)間處理金銀花多糖的得率

2.1.3 超聲溫度對(duì)金銀花多糖得率的影響 如圖3所示，隨著超聲溫度的升高，擴(kuò)散作用隨之增強(qiáng)，分子運(yùn)動(dòng)更加劇烈，多糖得率有升高的趨勢(shì)，但超過50℃后，多糖得率出現(xiàn)了明顯的下降，可能是由于高溫和超聲波破碎的協(xié)同作用導(dǎo)致部分金銀花多糖的結(jié)構(gòu)被破壞和降解[21]，且溫度過高容易造成溶劑氣化，不利于溶劑與物料的接觸，從而影響多糖得率[22]。因此，確定最佳超聲溫度為50℃。

圖3 不同超聲溫度處理金銀花多糖的得率

2.1.4 超聲功率對(duì)金銀花多糖得率的影響 如圖4所示，隨著超聲功率的增大，多糖得率呈上升趨勢(shì)，超聲功率為200 W時(shí)，多糖得率最高，但得率增加并不明顯，說明該因素對(duì)多糖得率的影響不大。因此，確定最佳超聲功率為200 W。

圖4 不同超聲功率處理金銀花多糖的得率

2.1.5 酶解pH值對(duì)金銀花多糖得率的影響 如圖5所示，隨著酶解pH值的增大，多糖得率先升高后下降，當(dāng)酶解pH值為6時(shí)，多糖的率最高。這是因?yàn)槊附鈖H值主要作用于纖維素酶，而纖維素酶發(fā)揮酶活性的最適pH值為4.5～6.5，當(dāng)提取液的pH值接近纖維素酶的最適pH值時(shí)，酶活性較大[23]。而多糖提取液的pH值為5，從簡(jiǎn)化試驗(yàn)的角度，確定最佳酶解pH值為5。

圖5 不同酶解pH值處理金銀花多糖的得率

2.1.6 酶用量對(duì)對(duì)金銀花多糖得率的影響 如圖6所示，隨著酶用量的增加，多糖得率不斷升高，是因?yàn)榧尤肜w維素酶導(dǎo)致細(xì)胞壁破壞，進(jìn)一步溶出多糖，且酶用量越多，酶與底物的反應(yīng)越充分，酶用量超過2.5%，多糖得率有下降趨勢(shì)，因?yàn)槊概c底物已經(jīng)充分反應(yīng)[24]，多余的酶不與底物作用，還有可能導(dǎo)致多糖降解[25]，使雜質(zhì)溶出。因此，確定最佳酶用量為2.5%。

圖6 不同酶用量處理金銀花多糖的得率

2.1.7 單因素顯著性差異分析

由SPSS22.0軟件單因素方差分析得出，料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、酶用量、酶解pH值對(duì)金銀花多糖得率影響的P值分別為0.000、0.202、0.037、0.920、0.044、0.932；其中，料液比對(duì)多糖得率有極顯著影響，超聲溫度、酶用量對(duì)多糖得率有顯著影響，而超聲時(shí)間、超聲功率、酶解pH值對(duì)多糖得率的影響不顯著。因此，選擇料液比、超聲溫度、酶用量這3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，得出響應(yīng)面方案與試驗(yàn)結(jié)果（表2）。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 模型建立與顯著性檢驗(yàn) 用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到回歸擬合方程為：Y=55.12+1.84X1+0.53X2-2.51X3-0.27X1X2-2.49X1X3+0.58X2X3-8.47X12-2.49X22-9.93X32。其中，Y為多糖得率，X1為酶用量，X2為超聲溫度，X3為料液比。

從表3可以看出，模型P值為0.000 2＜0.01，是極顯著的，且失擬項(xiàng)P=0.093 9＞0.05，不顯著，R2=0.967 8，表明該模型擬合效果好[26]，試驗(yàn)誤差較小，Radj2=0.926 4，表示有92%的響應(yīng)值變化可以用該模型解釋，同時(shí)也可以用該回歸方程預(yù)測(cè)提取率與多糖得率的關(guān)系，可信度較高。從表3還可以得出，3個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響由大到小排列依次為X3（料液比）＞X1（酶用量）＞X2（超聲溫度）；X1和X3及X1X3影響顯著 （P＜0.05），X12、X32影響高度顯著（P＜0.000 1），X2、X1X2、X2X3和X22影響不顯著。

表3 方差分析結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 曲面圖和等高線的形狀可直觀反映出料液比、酶用量及超聲溫度3個(gè)因素對(duì)金銀花多糖得率的影響。由圖7可知，任何2個(gè)交互因素都存在最大響應(yīng)值。由圖7A可知，當(dāng)料液比一定時(shí)，多糖得率隨著酶用量的增加而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，隨著超聲溫度的升高呈現(xiàn)平緩增大的趨勢(shì)；從等高線形狀可看出，酶用量和超聲溫度的交互作用對(duì)多糖得率影響不顯著，同時(shí)可以得出，酶用量對(duì)多糖得率的影響大于超聲溫度。由圖7B可知，當(dāng)超聲溫度一定時(shí)，多糖得率隨著酶用量的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，隨著料液比的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；從等高線形狀可看出，料液比和酶用量的交互作用對(duì)多糖得率的影響較顯著，同時(shí)可得出，料液比對(duì)多糖得率的影響大于酶用量。由圖7C可知，當(dāng)酶用量一定時(shí)，多糖得率隨著超聲溫度的升高而平緩增大，隨著料液比的增大而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，等高線的形狀可看出，料液比和超聲溫度的交互作用對(duì)多糖得率影響不顯著，同時(shí)可以得出，料液比對(duì)多糖得率的影響大于超聲溫度。從圖7還可以看出，圖7B的3D響應(yīng)曲面最為陡峭[27-29]，且等高線最為密集，其次為圖7C。因此，可判斷料液比與酶用量的交互作用對(duì)多糖得率的影響最大，其次為料液比與超聲溫度的交互作用的影響。綜合來看，3個(gè)單因素對(duì)多糖得率影響的順序表現(xiàn)為料液比＞酶用量＞超聲溫度，與方差分析表結(jié)果相符。

圖7 不同因素交互作用對(duì)金銀花多糖得率影響的響應(yīng)面與等高線圖

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，得出提取金銀花多糖的最優(yōu)工藝為：料液比1∶48（g/mL），超聲溫度50.83 ℃，酶用量2.56%，金銀花多糖的得率預(yù)測(cè)值為55.432 7%。根據(jù)實(shí)際情況對(duì)工藝進(jìn)行修正，修正后的試驗(yàn)條件為：料液比1∶48（g/mL），超聲溫度50.80 ℃，酶用量2.56%，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到的金銀花多糖平均得率為54.275%，與回歸模型預(yù)測(cè)的理論值相近，進(jìn)一步說明該模型可靠。

3 結(jié) 論

采用超聲法與酶法聯(lián)用提取金銀花多糖，相比傳統(tǒng)的水提法，具有節(jié)約時(shí)間和提高多糖得率的優(yōu)點(diǎn)。通過響應(yīng)面優(yōu)化法分析得出在料液比1∶48（g/mL），超聲溫度50.80 ℃，酶用量2.56%，超聲時(shí)間60 min，超聲功率200 W，酶解pH值為5的條件下，金銀花多糖平均得率為54.274 9%。與已有文獻(xiàn)相比，該方法大大提高了金銀花多糖得率，可為金銀花多糖的工廠化提取以及金銀花多糖生物活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。