茶輪斑病病原菌鑒定及其對(duì)茶皂素和茶多酚的敏感性

姚玉仙，張明澤，劉 榮，陳 志，江 榮，韋 梅，高雪靜

（黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州 都勻 558000）

茶輪斑?。╰ea grey blight）是一種半知菌亞門擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）病原菌，主要危害茶樹（Camellia sinensis）成葉和老葉，也可危害嫩葉和茶梢，引起葉片枯萎脫落，甚至整株死亡，已成為茶樹的主要病害之一[1-2]。茶輪斑病在世界各產(chǎn)茶區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，我國(guó)產(chǎn)茶各省發(fā)生均較普遍。近年來，國(guó)內(nèi)茶葉種植面積不斷擴(kuò)大，規(guī)?；潭炔粩嗵岣?，冬季氣溫回暖現(xiàn)象多有發(fā)生，致使茶輪斑病發(fā)生范圍擴(kuò)大、發(fā)生程度加重，嚴(yán)重影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。目前，防治茶樹病害常用的化學(xué)殺菌劑均不同程度地存在有毒性、污染環(huán)境及易引起抗藥性等問題[4]，而且一些有機(jī)茶園對(duì)化學(xué)農(nóng)藥要求較高。加上消費(fèi)者對(duì)茶葉質(zhì)量安全尤其對(duì)茶葉農(nóng)藥殘留越發(fā)關(guān)注[5]，發(fā)達(dá)國(guó)家或地區(qū)逐步提高的茶葉農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)成為我國(guó)茶葉出口的瓶頸，嚴(yán)重阻礙了茶葉貿(mào)易的發(fā)展[6]。植物源農(nóng)藥不會(huì)造成環(huán)境污染，不易使病菌產(chǎn)生抗藥性，利用植物源農(nóng)藥防治茶樹病蟲害更能保障茶葉的質(zhì)量安全。茶皂素（teasaponin）又名茶皂甙，是一類齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂甙的混合物。茶多酚（tea polyphenols）又名茶單寧，是一類從茶葉中提取出來的多羥基酚類混合物。茶皂素[7]和茶多酚[8]都是一種新型的天然抑菌劑，作為一種綠色植物源病原菌防治藥物，具有極大的開發(fā)潛力[9]。因此，筆者采用分子生物學(xué)方法鑒定病原菌，并測(cè)定茶皂素和茶多酚對(duì)該病原菌的抑制效果，以期為茶輪斑病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品采集：于貴州省都勻市紅敏茶園采集具有典型茶樹輪斑病癥狀的樣品。

供試藥劑：茶皂素（純度為20%～40%）和茶多酚（純度為95%）均購(gòu)買于阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶輪斑病病原菌的分離與純化 采用組織分離法分離病原菌，將采集的茶樹葉片用無菌水沖洗，用滅菌解剖刀在病、健交界處切下3.5 mm × 3.5 mm的帶病組織塊作為分離材料，再用75%乙醇消毒5 s，無菌水沖洗3次后接種至PDA培養(yǎng)基，放入27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后挑取菌落邊緣的菌絲進(jìn)行純化，純化后的菌株（DYHM-LB1）轉(zhuǎn)至PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后保菌。

1.2.2 茶輪斑病病原菌的分子生物學(xué)鑒定 采用CTAB法提取病原菌的總DNA，以ITS1（5'-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3'）及ITS4（5'-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'）為引物對(duì)茶輪斑病rDNA的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)展，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后送上海生工公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blastn同源性比對(duì)，分析并確定其分類地位。采用Clustalx1.83和MEGA7進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建NJ進(jìn)化樹，基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析方法選擇 Bootstrap method，重復(fù)次數(shù)為1000。

1.2.3 茶皂素和茶多酚對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定茶皂素和茶多酚對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性。茶皂素和茶多酚均設(shè)置5個(gè)濃度，分別取不同濃度的茶皂素、茶多酚1 mL加到冷卻至50℃左右的49 mL PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒入3個(gè)直徑為90 mm的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)（3次重復(fù)），使茶皂素終濃度分別為4、10、20、50、100 g/L，茶多酚終濃度分別為1、2、5、10、20 g/L，以添加1 mL無菌水的PDA培養(yǎng)基所倒平板為對(duì)照。待平板冷卻后，在平板中央放置已純化鑒定的茶輪斑病菌餅（直徑為0.55 cm），27℃恒溫培養(yǎng)。用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）×100/（對(duì)照菌落直徑-0.55）

1.2.4 毒力回歸方程和EC50計(jì)算 以對(duì)照接近長(zhǎng)滿平板當(dāng)天的菌落直徑計(jì)算茶皂素和茶多酚不同濃度抑制作用的毒力回歸方程，采用SPSS Statistics 26軟件開展毒力回歸方程的模擬和EC50的計(jì)算[10-11]。回歸概率分析中以抑菌直徑（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）為響應(yīng)頻率（S）、對(duì)照菌落直徑（減去接種菌餅直徑0.55 cm）為實(shí)測(cè)值總數(shù)（T）、濃度為協(xié)變量（C），轉(zhuǎn)換（N）是以10為底的對(duì)數(shù)，參數(shù)估算值中的“PROBIT模型”即為不同抑菌物質(zhì)的毒力回歸方程，采用卡方（x2）對(duì)回歸方程的擬合度進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶輪斑病病原菌的分離與純化

利用PDA培養(yǎng)基27℃恒溫培養(yǎng)分離純化茶輪斑病病原菌，得到純化菌株DYHM-LB1（圖1），菌落呈紋狀，大致呈圓形，邊緣稍有不規(guī)則，菌絲為白色，背面呈淡黃色。

圖1 菌株DYHM-LB1的菌落形態(tài)

2.2 茶輪斑病病原菌的分子生物學(xué)鑒定

序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)菌株DYHM-LB1與李應(yīng)祥等[12]發(fā)現(xiàn)的都勻市茶輪斑病病原菌序列的Query Cover為99%，Per.Ident為94.85%，而與P. theae（AY924274.1）及Pseudopestalotiopsis theae（HQ832793.1）的Query Cover均為100%，Per.Ident均為94.88%，與Neopestalotiopsis formicarum（LC521861.1）、Neopestalotiopsissp.（MN 337279.1）及Pseudopestalotiopsis sydowiana（MN856236.1）序列的Query Cover為100%，Per.Ident為99.77%。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示菌株DYHM-LB1與3株擬盤多毛孢菌（LC521861.1、MN337279.1和MN856236.1）聚為同一分支（圖2）。因此，將菌株DYHM-LB1初步鑒定為擬盤多毛孢屬真菌。

圖2 基于ITS序列茶輪斑病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 茶皂素和茶多酚對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制性測(cè)定

2.3.1 茶皂素和茶多酚對(duì)茶輪斑病的抑制效果 由圖3和圖4可知，添加不同濃度茶皂素及茶多酚的試驗(yàn)組均呈現(xiàn)出抑菌效果，其抑菌效果隨接種后天數(shù)及添加濃度的變化而變化，其中添加不同濃度茶皂素的試驗(yàn)組抑制率隨接種后天數(shù)的增加總體呈上升趨勢(shì)，而添加不同濃度茶多酚的試驗(yàn)組抑制率隨接種后天數(shù)的增加總體呈下降趨勢(shì)，試驗(yàn)組抑制效果均隨茶皂素和茶多酚濃度的增加而總體呈增強(qiáng)趨勢(shì)。茶皂素對(duì)茶輪斑病的抑制效果具有緩效性，而茶多酚的抑制效果具有速效性。

圖3 接種后1～6 d不同濃度茶皂素對(duì)茶輪斑病的抑制率

圖4 接種后1～5 d不同濃度茶多酚對(duì)茶輪斑病的抑制率

根據(jù)接種后每天抑菌率計(jì)算添加不同濃度茶皂素和茶多酚的平均日抑制率。由圖5可知，茶皂素濃度在4～50 g/L時(shí)平均日抑制率變化不大，在濃度達(dá)到100 g/L時(shí)平均日抑制率才有明顯升高；由圖6可知，不同濃度茶多酚平均日抑制率隨添加濃度的增加而增加。

圖5 不同濃度茶皂素對(duì)茶輪斑病的平均日抑制率

圖6 不同濃度茶多酚對(duì)茶輪斑病的平均日抑制率

2.3.2 茶皂素和茶多酚對(duì)茶輪斑病毒力回歸方程分析以對(duì)照菌絲接近長(zhǎng)滿平板時(shí)的菌落直徑計(jì)算茶皂素和茶多酚不同濃度抑制作用的毒力回歸方程，采用卡方檢驗(yàn)（x2）驗(yàn)證回歸方程的擬合度。由表1可知，x2測(cè)定值均小于檢驗(yàn)的臨界值7.815（x20.05，自由度為3），且P值均大于0.05，表明實(shí)際測(cè)定結(jié)果與理論測(cè)定結(jié)果差異不顯著，卡方（x2）檢驗(yàn)結(jié)果表明毒力回歸方程擬合度良好。EC50反映了藥物對(duì)供試病原菌的抑制能力，EC50值越低，表明藥物抑菌活性越好，茶皂素抑制茶輪斑病的EC50為0.044 g/L，而茶多酚的EC50為297.397 g/L，表明茶皂素對(duì)茶輪斑病的抑制效果顯著高于茶多酚。

表1 茶皂素和茶多酚對(duì)茶輪斑病的毒力

3 討 論

茶輪斑病是目前我國(guó)茶園中發(fā)生相當(dāng)普遍的病害之一，主要是由茶擬盤多毛孢侵染發(fā)病，關(guān)于該病的病原菌一直有不同的報(bào)道[13]，可能與擬盤多毛孢屬的劃分標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)，Maharachchikumbura等[14]依據(jù)rDNA-ITS、β-tub和EF-1α基因序列對(duì)擬盤多毛孢屬的分類進(jìn)行了修訂，并從此屬中劃分出了新擬盤多毛孢和假擬盤多毛孢2個(gè)屬。李應(yīng)祥等[12]鑒定貴州都勻茶區(qū)茶輪斑病的病原菌為茶擬盤多毛孢菌（P. theae），李冬雪等[15]將貴州惠水茶區(qū)茶輪斑病的病原菌GZHS-2017-01鑒定為茶假擬盤多毛孢（Ps.camelliae-sinensis），筆者的研究中的菌株DYHM-LB1經(jīng)序列比對(duì)和聚類分析初步鑒定為擬盤多毛孢屬真菌，但該菌株序列與都勻茶區(qū)茶輪斑病病原菌[12]、P.theae（AY924274.1）和N. formicarum（LC521861.1）等菌株的序列相似性存在差異，這可能與菌株生長(zhǎng)的地域、環(huán)境和寄主等因素有關(guān)[15]。

黃繼光等[16]研究發(fā)現(xiàn)茶皂素對(duì)12種植物病原菌有良好的抑菌活性，筆者的研究顯示茶皂素對(duì)茶輪斑病也有較好的抑制效果，且抑制效果具有緩效性。茶皂素和茶多酚對(duì)茶輪斑病均有抑制作用，茶皂素的抑制效果顯著高于茶多酚，這與鄒東霞等[17]關(guān)于茶皂素和茶多酚對(duì)八角炭疽病菌均有抑制作用，但茶皂素的抑制作用強(qiáng)于茶多酚的研究結(jié)果相類似。茶皂素的抑菌作用強(qiáng)于茶多酚，這可能與茶皂素和茶多酚對(duì)病原菌抑菌的作用機(jī)理不同有關(guān)。張慧勤[18]研究發(fā)現(xiàn)茶皂素通過破壞細(xì)胞膜的通透性，影響膜上和胞內(nèi)相關(guān)酶的活性，促進(jìn)膜上蛋白質(zhì)酶和幾丁質(zhì)酶加速分解蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞壁的完整性被破壞而起到抑菌作用。張新富[19]用油茶皂苷處理玉米小斑病菌菌絲，發(fā)現(xiàn)其頂端及中部細(xì)胞膨大呈泡囊狀，阻礙了菌絲的生長(zhǎng)。李柯欣[20]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)酵母和霉菌等真菌的抑制作用不明顯，茶多酚是通過抑制細(xì)菌的蛋白酶、淀粉酶和水解酶等酶類活性，導(dǎo)致細(xì)菌不能從外界分解、攝取蛋白質(zhì)及碳水化合物而發(fā)揮抑菌作用，但當(dāng)微生物所處外界環(huán)境中有足夠的氨基酸和葡萄糖時(shí)，即使微生物的水解酶類被抑制，其仍不會(huì)受到茶多酚的抑制。該研究中茶多酚對(duì)茶輪斑病的抑制效果隨接種天數(shù)的增加抑制率下降的現(xiàn)象可能與茶多酚的這種抑菌機(jī)制有關(guān)。茶皂素和茶多酚大田試驗(yàn)的抑菌效果及不同茶樹株系的茶皂素和茶多酚含量是否會(huì)影響其抗病性等有待進(jìn)一步研究。