miR-429靶向肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D調(diào)控Hippo/YAP信號通路對舌鱗癌細(xì)胞的影響

劉 鳴，黃 浩，鐘曉敏，聶智亮，雷 靂，孫秋榕

0 引 言

舌鱗癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年升高[1]。目前，舌鱗癌的治療以手術(shù)、放療和化療為主，但缺乏特異的靶向治療藥物。舌鱗癌的發(fā)病機(jī)制尚未明了，探究其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制可為其發(fā)病機(jī)制的闡明及治療靶點(diǎn)的選擇提供新途徑。微小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA，其可靶向其靶基因的表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡等生命過程。近年來研究顯示，腫瘤中存在大量異常表達(dá)的miRNA，這些miRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，可作為腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[2-3]。miR-429是miR-200家族的成員，其在卵巢癌[4]、肝癌[5]、食管鱗狀細(xì)胞癌[6]和甲狀腺乳頭狀癌[7]等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，通過上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型，進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)展進(jìn)程。有報(bào)道稱，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-429表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖，miR-429可能是舌鱗癌治療的分子靶點(diǎn)[8]。

Targetscan靶基因在線軟件預(yù)測顯示，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D(myocyte enhancer 2D，MEF2D)可能是miR-429的靶基因。MEF2D是MEF2家族成員之一，其在多種腫瘤中表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤發(fā)展進(jìn)程。例如，MEF2D在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，通過靶向抑制其表達(dá)可削弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性，MEF2D在膠質(zhì)瘤中起促癌基因作用[9]。然而，MEF2D對舌鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響及miR-429能否靶向MEF2D影響舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展尚未闡明。本研究主要探究miR-429和MEF2D對舌鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響及miR-429能否靶向MEF2D發(fā)揮作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2017年4月至2019年10月贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科行手術(shù)切除的33例舌鱗癌患者的組織及癌旁組織標(biāo)本。液氮保存，其中男19例，女14例，平均年齡(59.28±7.45)歲。按照國際抗癌聯(lián)盟及美國癌癥聯(lián)合會(UICC/AJCC)(第8版)進(jìn)行TNM分期[10]，I期5例，II 期14例，III期11例，IV期3例；依據(jù)組織分化程度不同分為高分化6例，中分化12例，低分化15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次確診；術(shù)前未行放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；合并心、肝、腎等重要器官功能障礙者；合并糖尿病等慢性病患者。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：LLSC-2021042901)，患者均簽署知情同意書。

1.2細(xì)胞和試劑舌鱗癌細(xì)胞株CAL 27取自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自大連寶生物；RPMI 1640培養(yǎng)液、雙熒光素酶活性檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶；胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司；PCR引物、miR-429 模擬物(mimcs)、模擬對照序列(miR-NC)、MEF2D小干擾RNA(si-MEF2D)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)、MEF2D過表達(dá)載體(pcDNA-MEF2D)購自上海生工；LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；兔抗人MEF2D、磷酸化Yes相關(guān)蛋白(phosphorylated Yes-associatedprotein，p-YAP)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3方法

1.3.1 RT-qPCR法檢測miR-429和MEF2D mRNA表達(dá)用RNA抽提試劑盒提取組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃5 min；95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-429上游5'-CGGTAATACTGTCTGGTAA-3'，下游5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；MEF2D上游5'-CGTTGGGAATGGCTATGTC-3'，下游5'-GAGGCCCTGGCTGAGTAA-3'；GAPDH上游5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。2-△△Ct法計(jì)算miR-429相對于U6、MEF2D mRNA相對于GAPDH的表達(dá)量。

1.3.2舌鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染復(fù)蘇舌鱗癌細(xì)胞，用含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。取對數(shù)期細(xì)胞將其接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，當(dāng)細(xì)胞生長密度至80 %時(shí)，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染miR-NC(miR-NC組)、miR-429 mimics(miR-429組)、si-NC(si-NC組)、si-MEF2D(si-MEF2D組)、pcDNA(pcDNA組)、pcDNA-MEF2(pcDNA-MEF2組)、共轉(zhuǎn)染miR-429 mimics與pcDNA-MEF2(miR-429+pcDNA-MEF2組)，轉(zhuǎn)染時(shí)間為12 h。更換新鮮培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h，RT-qPCR法檢測細(xì)胞中MEF2D或miR-429表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，方法同1.3.1，并收集細(xì)胞備用。同時(shí)設(shè)置對照組(細(xì)胞不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作，用常規(guī)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng))。

1.3.3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖將各組細(xì)胞均接種至96孔板中(2.5×104個(gè)/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，加10 μL CCK-8試劑，孵育2 h，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)測光密度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4克隆形成實(shí)驗(yàn)將各組細(xì)胞接種至6孔板中(1.0×104個(gè)/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每2 d換一次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d后，棄培養(yǎng)液。用4 % 多聚甲醛固定30 min，0.4 %結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡觀察，統(tǒng)計(jì)超過50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將各組細(xì)胞接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，并PBS清洗2次，于離心半徑10 cm的離心機(jī)，1500 r/min離心5 min，棄PBS。加500 μL結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞。然后依次加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移將各組細(xì)胞均接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液。用200 μL無菌移液器槍頭沿中軸線在培養(yǎng)板底部劃兩條平行線，并用PBS沖洗掉劃痕間細(xì)胞，測量劃痕間距d，記為d0 h。更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，再次測量細(xì)胞間間距d，記為d24 h。細(xì)胞遷移距離=d0 h-d24 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7蛋白質(zhì)印跡法檢測MEF2D和p-YAP蛋白表達(dá)將各組細(xì)胞接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白。經(jīng)BCA定量、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，分別用MEF2D(1∶1000)、p-YAP(1∶1000)和GAPDH(1∶1000)一抗孵育液，4 ℃孵育過夜。再用山羊抗兔二抗(1∶1000)孵育液，37 ℃孵育2 h。加顯影液避光顯影，凝膠系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析MEF2D和p-YAP相對于GAPDH的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)根據(jù)StarBase靶基因在線軟件預(yù)測顯示的MEF2D與miR-429的核苷酸序列的結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建MEF2D野生型熒光素酶報(bào)告基因載體(wt-MEF2D)和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體(mut-MEF2D)，該過程由上海生工生物工程股份有限公司完成。取對數(shù)期細(xì)胞將其接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，當(dāng)細(xì)胞生長密度至80 %時(shí)，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別共轉(zhuǎn)染miR-429 mimics與wt-MEF2D(miR-429 +wt-MEF2D組)、miR-NC與wt-MEF2D(miR-NC+wt-MEF2D組)、miR-429 mimics與mut-MEF2D(miR-429+mut-MEF2D組)、miR-NC與mut-MEF2D(miR-NC+mut-MEF2D組)至舌鱗癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間為12 h。更換新鮮培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并裂解，于離心半徑10 cm的離心機(jī)，3500 r/min離心10 min后，取上清，檢測熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲熒光強(qiáng)度與海腎熒光強(qiáng)度的比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 miR-429和MEF2D在舌鱗癌中的表達(dá)舌鱗癌組織中miR-429的表達(dá)低于癌旁組織(P<0.05)，MEF2D mRNA的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)，且舌鱗癌組織中miR-429和MEF2D mRNA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.992，P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 舌鱗癌組織中miR-429與MEF2D mRNA的相關(guān)分析Figure 1 There was a negative correlation between miR-429 and MEF2D mRNA in tongue squamous cell carcinoma

表1 舌鱗癌組織中miR-429和MEF2D mRNA的表達(dá)水平Table 1 Expression levels of miR-429 and MEF2D mRNA in tongue squamous cell carcinoma

2.2上調(diào)miR-429對舌鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響miR-429組舌鱗癌細(xì)胞中miR-429的表達(dá)高于對照組、miR-NC組(P<0.05)，而對照組與miR-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明上調(diào)miR-429的舌鱗癌細(xì)胞構(gòu)建成功。見表2。miR-429組舌鱗癌細(xì)胞凋亡率、p-YAP蛋白表達(dá)較對照組、miR-NC組顯著升高(P<0.05)。見圖2、圖3，表2。與對照組、miR-NC組比較，miR-429組舌鱗癌細(xì)胞A值、集落形成數(shù)和遷移距離、MEF2D蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖4，表2。說明上調(diào)miR-429抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲，加劇細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞中MEF2D蛋白表達(dá)，而激活Hippo/YAP信號通路。

圖2 上調(diào)miR-429促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞凋亡Figure 2 Up regulation of miR-429 promotes apoptosis of tongue squamous cell carcinoma cells

1:對照組; 2:miR-NC組; 3:miR-429組圖3 上調(diào)miR-429后舌鱗癌細(xì)胞中MEF2D蛋白及YAP的表達(dá)Figure 3 Up regulation of miR-429 inhibits the expression of MEF2D protein and Yap protein in tongue squamous cell carcinoma cells

表2 上調(diào)miR-429對舌鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響Table 2 Effects of up-regulatingmiR-429 on proliferation, apoptosis and migration of tongue squamous cell carcinoma cells

圖示miR-429組遷移距離較對照組、miR-NC組顯著降低圖4 上調(diào)miR-429后舌鱗癌細(xì)胞遷移情況Figure 4 Up regulation of miR-429 inhibits tongue squamous cell carcinoma cell migration

2.3miR-429靶向結(jié)合MEF2DTargetscan靶基因在線軟件預(yù)測顯示，miR-429與MEF2D的3'UTR含有互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖5。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC+wt-MEF2D組比較，miR-429+wt-MEF2D組舌鱗癌細(xì)胞熒光素酶活性降低[(0.22±0.01)vs(1.03±0.09),P<0.05]；與miR-NC+mut-MEF2D組比較，miR-429+mut-MEF2D組舌鱗癌細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化[(1.03±0.07)vs(1.02±0.08),P>0.05]，說明MEF2D是miR-429的靶基因。

圖5 Targetscan靶基因在線軟件預(yù)測miR-429與MEF2D的3'UTR互補(bǔ)核苷酸序列Figure 5 The effect of down-regulation of MEF2D on the apoptosis of tongue squamous cell carcinoma cells and the expression of p-YAP protein

2.4舌鱗癌細(xì)胞中下調(diào)或上調(diào)MEF2D的效果驗(yàn)證si-MEF2D組舌鱗癌細(xì)胞中MEF2D蛋白表達(dá)低于對照組、si-NC組(P<0.05)，說明下調(diào)MEF2D的舌鱗癌細(xì)胞構(gòu)建成功。pcDNA-MEF2D組舌鱗癌細(xì)胞中MEF2D蛋白表達(dá)(1.04±0.07)明顯高于對照組(0.66±0.05)、pcDNA組(0.65±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明上調(diào)MEF2D的舌鱗癌細(xì)胞構(gòu)建成功。見圖6。

1：對照組；2：si-NC組；3：si-MEF2D組；4：pcDNA組；5：pcDNA-MEF2D組圖6 MEF2D蛋白表達(dá)的檢測Figure 6 Detection of MEF2D protein expression

2.5下調(diào)MEF2D對舌鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響si-MEF2D組舌鱗癌細(xì)胞凋亡率、p-YAP蛋白表達(dá)較對照組、si-NC組顯著升高(P<0.05)。見圖7、圖8，表3。與對照組、si-NC組比較，si-MEF2D組舌鱗癌細(xì)胞A值、集落形成數(shù)和遷移距離顯著降低(P<0.05)。見圖9，表3。說明下調(diào)MEF2D抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲，加劇細(xì)胞凋亡，并激活細(xì)胞中Hippo/YAP信號通路。

圖7 下調(diào)MEF2D后對舌鱗癌細(xì)胞凋亡影響Figure 7 Down-regulation of MEF2D promotes apoptosis of tongue squamous cell carcinoma cells

1：對照組；2：si-NC組；3：si-MEF2D組圖8 下調(diào)MEF2D抑制舌鱗癌細(xì)胞中YAP蛋白表達(dá)Figure 8 Down-regulation of MEF2D inhibits theexpressionofYAPproteinin tongue squamous cell carcinoma cells

圖9 下調(diào)MEF2D抑制舌鱗癌細(xì)胞遷移Figure 9 Down-regulationof MEF2Dinhibits the migration of tongue squamous cell carcinoma cells

表3 下調(diào)MEF2D對舌鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響Table 3 Effects of down regulating MEF2D on proliferation, migration and apoptosis of tongue squamous cell carcinoma cells

2.6上調(diào)MEF2D降低上調(diào)miR-429對舌鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響miR-429組舌鱗癌細(xì)胞凋亡率、p-YAP蛋白表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.05)；miR-429+pcDNA-MEF2D組較miR-429組顯著降低(P<0.05)。見圖10、圖11，表4。與對照組比較，miR-429組舌鱗癌細(xì)胞A值、集落形成數(shù)和遷移距離顯著降低(P<0.05)。與miR-429組比較，miR-429+pcDNA-MEF2D組舌鱗癌細(xì)胞A值、集落形成數(shù)和遷移距離顯著升高(P<0.05)。見圖12，表4。說明上調(diào)MEF2D降低上調(diào)miR-429對舌鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響。

圖10 上調(diào)MEF2D降低上調(diào)miR-429對舌鱗癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用Figure 10 Up-regulation of MEF2D reduces the effect of up-regulation of miR-429 on the apoptosis of tongue squamous cell carcinoma cells

1：對照組；2：miR-429組；3：miR-429+pcDNA-MEF2D組圖11 上調(diào)MEF2D降低上調(diào)miR-429對舌鱗癌細(xì)胞中YAP蛋白表達(dá)的抑制作用Figure 11 Up-regulation of MEF2D reduces the inhibitory effect of up-regulation of miR-429 on the expressionofYAP protein in tongue squamous cell carcinoma cells

圖示miR-429+pcDNA-MEF2D組遷移距離較對照組、miR-429組顯著升高圖12 上調(diào)MEF2D降低上調(diào)miR-429對舌鱗癌細(xì)胞遷移的的抑制作用Figure 12 Up-regulation of MEF2D reduces the inhibitory effect of up-regulation of miR-429 on the migration of tongue squamous cell carcinoma cells

表4 上調(diào)MEF2D降低上調(diào)miR-429對舌鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響Table 4 Up-regulation of MEF2D reduces the effect of up-regulation of miR-429 on the proliferation, migration and apoptosis of tongue squamous cell carcinoma cells

3 討 論

舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)，探究舌鱗癌中異常表達(dá)的基因分子及其對該腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響可為其治療提供分子靶點(diǎn)。miRNA在真核生物中廣泛存在，其可通過靶向其靶基因的表達(dá)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等惡性表型，是腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)。研究表明，miR-431-5p[11]、miR-543[12]和miR-138-5p[13]等多種miRNA在舌鱗癌中異常低表達(dá)，對舌鱗癌的發(fā)展起抑制作用；而miR-21-5p[14]、miR-17-5p[15]等miRNA在舌鱗癌中表達(dá)升高，促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的惡性生物性行為，進(jìn)而促進(jìn)對舌鱗癌的發(fā)展進(jìn)程。這些研究結(jié)果表明，不同的miRNA在舌鱗癌中發(fā)揮的作用不同。

作為一種miRNA，miR-429參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-429表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可通過靶向抑制HMGB3來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miR-429/HMGB3軸在結(jié)直腸癌中具有特定的腫瘤抑制功能[16]；miR-429可通過靶向FN1抑制Wnt/β-catenin信號通路，降低乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[17]；miR-429在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其可通過靶向HOXA9進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活來抑制骨肉瘤的發(fā)展進(jìn)程[18]。本研究結(jié)果顯示，舌鱗癌組織中miR-429表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可阻礙舌鱗癌細(xì)胞增殖和遷移，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與Ma等[19]報(bào)道的結(jié)果一致，提示miR-429對舌鱗癌發(fā)展起抑制作用，其可能成為舌鱗癌治療的分子靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步探究miR-429調(diào)控舌鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了MEF2D是miR-429的靶基因。此外，上調(diào)miR-429抑制了舌鱗癌細(xì)胞中MEF2D的表達(dá)，進(jìn)而說明了miR-429靶向負(fù)調(diào)控MEF2D，且與本研究結(jié)果舌鱗癌組織中miR-429與MEF2D mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果一致。研究顯示，miR-335的過表達(dá)可通過靶向MEF2D降低膽囊癌細(xì)胞活力和集落形成能力，并阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程[20]；miR-30a在肺癌中表達(dá)降低，這引起其靶基因MEF2D表達(dá)的增加，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，加速肺癌發(fā)展進(jìn)程[21]。本研究結(jié)果顯示，舌鱗癌組織中MEF2D表達(dá)升高，通過下調(diào)MEF2D表達(dá)可顯著降低舌鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果還顯示，上調(diào)MEF2D降低了上調(diào)miR-429對舌鱗癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用及凋亡促進(jìn)作用，進(jìn)而提示miR-429通過靶向抑制MEF2D的表達(dá)來抑制舌鱗癌細(xì)胞惡性表型。

Hippo/YAP信號通路是參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等生命活動的重要通路，其主要組成部分包括Mst1/2、Sav1、Mob1和Lats1/2系列的核心激酶鏈及下游核心效應(yīng)因子Yes相關(guān)蛋白(YAP)。YAP是一個(gè)癌基因，其不直接與DNA結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，而是在進(jìn)入細(xì)胞核后與特定的轉(zhuǎn)錄因子TEAD結(jié)合，然后啟動下游癌基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而發(fā)揮惡性生物學(xué)行為[22]。正常生理狀態(tài)下，Hippo/YAP信號通路處于激活狀態(tài)，系列的激酶作用使YAP磷酸化，并與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白結(jié)合滯留在細(xì)胞質(zhì)中或被泛素化降解，從而抑制YAP下游作用的癌基因表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[23]。有報(bào)道稱，circ_0128846可通過降低miR-1184的表達(dá)，從而增加AJUBA的表達(dá)并使Hippo/YAP信號通路失活，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展[24]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-429或下調(diào)MEF2D均可促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞中YAP的磷酸化水平，而上調(diào)MEF2D逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-429對舌鱗癌細(xì)胞中YAP磷酸化的促進(jìn)作用，提示miR-429通過靶向MEF2D進(jìn)而激活Hippo/YAP信號通路來抑制舌鱗癌細(xì)胞的惡性表型。

綜上，miR-429在舌鱗癌組織中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)能夠降低舌鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，并誘導(dǎo)舌鱗癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向抑制MEF2D進(jìn)而激活Hippo/YAP信號通路有關(guān)，miR-429/MEF2D/Hippo/YAP軸可能為舌鱗癌的治療提供了新的途徑。但本研究尚需通過裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證miR-429/MEF2D/Hippo/YAP軸對舌鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響。