Caerin多肽在提高人乳頭瘤病毒相關惡性腫瘤治療性疫苗效率中的研究進展

馬博偉綜述，倪國穎，王天放，陳波蓓審校

0 引 言

近年來，免疫治療逐漸成為腫瘤治療的新手段，免疫檢查點抑制對多種惡性腫瘤顯示出明確的療效和巨大的潛能[1-3]。免疫檢查點抑制劑如抗PD-1、抗CTLA-4抗體等對包括宮頸癌、HPV相關頭頸部腫瘤在內(nèi)的臨床試驗中也顯示出明確療效[4-6]。但是，免疫檢查點抑制劑對相當一部分腫瘤無效，仍需進一步提高療效[7]。治療性疫苗通過誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTLs)特異性殺死腫瘤或病毒感染細胞，理論上不傷害正常細胞，已成為包括宮頸癌免疫治療在內(nèi)的腫瘤免疫治療領域的研究熱點[8]。動物實驗和臨床試驗結果也表明，治療性疫苗與免疫檢查點抑制治療聯(lián)合使用，可進一步提高免疫檢查點的效率[8-9]。本文對人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)相關腫瘤治療性疫苗的研究現(xiàn)狀作一綜述，重點就Caerin多肽提高HPV相關腫瘤治療性疫苗效率進行的探索。

1 HPV相關惡性腫瘤

HPV慢性持續(xù)感染可引起多種良性和惡性疾病。宮頸、外陰、肛門癌和部分頭頸部腫瘤均可由感染HPV引起。2012年HPV持續(xù)感染引起的癌癥占當年一千四百萬新診斷癌癥患者的4.6%[10]。2018年的統(tǒng)計表明，HPV相關癌癥占所有二百二十萬與感染有關癌癥的29.1%，而幾乎100%的宮頸癌均由HPV感染引起[11]。

宮頸癌是常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率占女性惡性腫瘤第四位，其中高危HPV 16型或18型在宮頸癌中最常見，約50%的宮頸癌發(fā)生與感染HPV16有關， 20%的宮頸癌發(fā)生與HPV18有關[12]。HPV預防疫苗主要由HPV晚期L1衣殼蛋白組成，L1蛋白可在體外自主組裝成病毒樣顆粒(virus like particles，VLPs)，VLPs可誘導機體產(chǎn)生抗L1中和抗體，從而預防HPV病毒感染[13]。盡管用于預防HPV 感染的疫苗早已于2006年開始應用，但此類疫苗僅適用于從未感染的健康個體，對現(xiàn)癥HPV感染及其所致疾病無效[14]。雖然宮頸癌預防性疫苗已經(jīng)在世界范圍內(nèi)使用，宮頸癌仍是婦女，尤其是發(fā)展中國家婦女最常見的惡性腫瘤之一[12]。2018年全球宮頸癌新診斷人數(shù)為570 000人，死亡 311 000人[15]。我國現(xiàn)有宮頸癌患者40萬人，死亡率達11.3%[16]。

頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是全球第六大最常見的癌癥，每年新診斷患者60萬，死亡人數(shù)超過30萬人[17]。根據(jù)HPV相關性，HNSCC患者可分為兩類不同的亞群，HPV陰性的HNSCC可能與環(huán)境致癌物、煙酒消費有關；而HPV陽性的HNSCC主要由HPV16亞型引起。HPV陽性的HNSCC好發(fā)于口咽部、扁桃體或舌根鱗狀上皮內(nèi)，通常見于不吸煙的年輕患者。許多HNSCC表現(xiàn)為局部進展性疾病，常伴有明顯的淋巴結受累[18]。局部晚期疾病采用手術、放療和化療相結合的方法，只有約50%的患者能治愈。HPV陽性腫瘤相對于陰性腫瘤具有更好的臨床治療效果[19-20]。我國南方HPV相關HNSCC患者約占所有HNSCC的26.4%，口咽癌HPV的陽性率達到了38.5%[21]。

2 HPV相關疾病的治療性疫苗研究現(xiàn)狀和存在問題

目前，國內(nèi)外HPV治療性疫苗仍處在試驗探索和研發(fā)階段。HPV治療性疫苗的靶抗原明確，主要集中在HPV早期抗原E6和E7。HPV相關惡性腫瘤中E6，E7持續(xù)表達，是主要的致癌蛋白。已有多篇文獻發(fā)表有關HPV治療性疫苗的綜述[8,22]。疫苗主要包括DNA(基因疫苗)、mRNA疫苗、各種細菌或病毒載體搭載的疫苗、蛋白質、細胞和肽類疫苗等[23]。

迄今，國際上已有多篇文獻報道了HPV相關治療性疫苗的臨床試驗結果，但僅個別，如含弗氏不完全佐劑的長HPV16 E7多肽疫苗和一種核酸疫苗顯示對HPV感染癌前病變?nèi)鏑IN3或VIN3有療效[24-26]，但對宮頸癌療效不明確?，F(xiàn)階段，HPV治療性疫苗主要問題是接種HPV治療性疫苗雖然可誘導患者產(chǎn)生CTLs，這些T 細胞也可浸潤到腫瘤組織，但是對患者的生存時間無改善。如何優(yōu)化HPV相關疾病治療性疫苗、提高其療效，已成為HPV相關疾病治療性疫苗研究領域亟待解決的命題。理想的HPV治療性疫苗應該：①誘導產(chǎn)生高質、足夠數(shù)量的效應T細胞細胞；②這些T細胞可遷徙到腫瘤組織；③克服腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用，有效殺死腫瘤細胞[14, 24-27]。

3 免疫時阻斷白介素10可提高治療性疫苗療效

3.1 IL-10IL-10是一種由多種特異性和非特異性免疫細胞分泌的細胞因子，IL-10家族細胞因子由IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26、IL-28A、IL-28B和IL-29組成[28]。具有多種生物學功能，可抑制機體對外源和自身抗原過度的免疫反應，避免對機體自身免疫損傷，維持上皮層的完整性，促進對致病性感染的固有免疫反應，促進損傷中的組織愈合過程，抑制促反射反應，限制不必要的組織破壞[28]?？乖岢始毎鐦渫粻罴毎?、巨噬細胞，輔助T 細胞，如Th1、Th2和Th17細胞以及CD8+T細胞，在特定條件下均可分泌IL-10。IL-10的主要功能是通過與細胞膜上的IL-10受體(IL-10R)結合，降低炎癥反應。IL-10通過作用于抗原遞呈細胞，抑制CD8+T和Th1、Th17等細胞反應[29-31]。

3.2阻斷IL-10提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應乳頭瘤病毒(papillomavirus，PV)的主要衣殼蛋白L1致敏(primed)的小鼠，在接種攜帶HPV16E7 CTLs決定簇的PV嵌和型L1蛋白(L1E7)后，與未致敏小鼠相比，E7特異性的CTLs細胞分泌干擾素伽馬(IFN-γ)受到抑制。但在 L1E7免疫PV L1致敏小鼠時，同步用IL-10受體抗體阻斷IL-10信號傳遞，E7特異性CTLs不受到抑制[32-34]。

基于多肽的治療性疫苗易生產(chǎn)，便于保存而受到研究者的重視。長HPV16 E7多肽(Long E7 peptide)/IFA疫苗是經(jīng)過隨機對照雙盲臨床試驗證實對宮頸癌癌前病變有明確療效的[28]。對比研究發(fā)現(xiàn)HPV16 E7長肽/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/抗IL-10受體抗體疫苗比HPV16 E7 長肽/IFA誘導產(chǎn)生更多的E7特異性CTLs，并且促使更多的分泌干擾素γ的CD4+和CD8+T細胞浸潤腫瘤組織[35-36]。兩種免疫方法均可抑制HPV16 E6/E7轉化的TC-1小鼠腫瘤的生長，且抑制水平一致。免疫時阻斷IL-10還可提高誘導次要抗原決定簇CTLs的能力。另外，已在臨床上使用的佐劑MPLA，一種優(yōu)化的LPS類似物，皮下使用抗IL-10R抗體，也可提高疫苗誘導CTLs的能力[35-36]。

3.3含IL-10阻斷劑的治療性疫苗更好的抑制腫瘤生長無論免疫原是病毒樣顆粒、多肽、可溶性抗原或核苷酸，免疫時使用IL-10受體單克隆抗體阻斷IL-10可顯著增加疫苗誘導抗原特異性CD8+T細胞反應[37]。HPV16 E7長肽/脂多糖 (LPS)/IL-10 阻斷(抗IL-10R 抗體)疫苗和HPV16 E7長肽/IFA 免疫后，這兩種免疫方法與未經(jīng)免疫的荷瘤小鼠相比，其腫瘤組織中IFN-γ的水平相似，比未免疫對照組腫瘤高；但是IL-10水平三者相似，提示腫瘤組織中的IFN-γ對抑制腫瘤起重要作用，而免疫時阻斷IL-10，不影響腫瘤組織中IL-10 總體水平[35-36]。免疫時阻斷IL-10，比單純免疫可更好抑制TC-1腫瘤的生長[38-39]。這些結果表明IL-10信號傳導阻斷對癌癥治療疫苗是有益的。疫苗誘導的IL-10而不是源自腫瘤的IL-10決定了治療性疫苗的效力[38]。然而，當含有不誘導IL-10的佐劑的疫苗，如TLR3激動劑(Poly(I:C))或抗CD40抗體時，由于這些佐劑刺激的樹突狀細胞(DC)不產(chǎn)生IL-10，因此抗IL-10R抗體將不會對腫瘤生長提供任何有益的作用[39-40]。 IL-10在免疫應答的T細胞激活和啟動階段是有害的，通過抑制抗原遞呈和減少MHC Ⅰ、Ⅱ和樹突狀細胞膜上的共刺激物表達來抑制樹突狀細胞。因此，阻斷樹突狀細胞疫苗上的IL-10信號會產(chǎn)生更強的抗腫瘤反應[38]。

4 腫瘤微環(huán)境對效應T細胞的抑制作用

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是腫瘤與機體免疫系統(tǒng)不斷斗爭并取得勝利的結果。腫瘤微環(huán)境的組成包括腫瘤局部浸潤的免疫細胞、間質細胞及腫瘤細胞等。間質細胞又包括腫瘤相關成纖維細胞、淋巴細胞、骨髓前體細胞和循環(huán)血小板等細胞[41-43]。腫瘤微環(huán)境中存在大量的免疫抑制細胞，如調(diào)節(jié)性T細胞，免疫抑制性的抗原提呈細胞等，可直接或通過分泌免疫抑制細胞因子，如IL-10，TGF-β對效應T細胞，特別是CTLs的功能進行抑制[44]。 腫瘤微環(huán)境中M2表型巨噬細胞的增多，M2表型的巨噬細胞具有分泌促腫瘤生長炎性因子，特別是IL-10和CCL-2升高，從而引起腫瘤細胞遷徙和轉移。 因此，提高治療型疫苗的效率需要使免疫微環(huán)境從免疫抑制變成免疫促進狀態(tài)[42,45]。

5 Caerin多肽體內(nèi)外抑制腫瘤生長

分離自兩棲動物澳大利亞樹蛙皮膚分泌物的天然多肽Caerin 1.1具有廣譜癌細胞細胞毒性作用,包括對白血病、肺癌、結腸癌、黑素瘤、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和乳腺癌細胞的體外細胞毒性作用等，Caerin 1.9具有廣譜的抗革蘭氏陽性和陰性細菌的能力[46-48]。

Caerin 1.1 和 1.9兩者結合使用體外抑制HPV16E6/E7轉化的TC-1腫瘤細胞，宮頸癌Hela細胞生長有疊加作用，而相同劑量的Caerin 多肽對正常細胞無毒性[49-50]。Caerin1.9可進入到TC-1和HeLa細胞內(nèi)，Caerin 1.9進入細胞內(nèi)的速度和位于細胞內(nèi)的位置不同[50]。Caerin 1.1和Caerin 1.9誘導TC-1和人宮頸癌HeLa細胞凋亡，可能通過TNFα介導的凋亡信號誘導HeLa細胞凋亡[50]。Caerin多肽二級結構α螺旋-中部鉸鏈-α螺旋，能夠影響細胞膜結構，造成細胞膜功能的破壞，導致有過量離子和小分子穿過細胞質膜雙層，最終導致細胞裂解而造成細胞死亡[51]。Caerin多肽可通過Tec激酶信號傳導和LXR/RXR通路引起急性炎癥[49]。的確，Caerin1.1和Caerin1.9使TC-1細胞分泌更多的IL-6[49]。放射性碘可被連接到caerin多肽上。放射性碘標記的Caerin 1.9在體外抑制腫瘤生長的效率比未標記的Caerin 1.9高100倍，與游離的放射性碘比較，殺傷腫瘤細胞的效率更高[52-53],同樣，放射性碘標記的Caerin 1.1在體內(nèi)抑制腫瘤生長的效率比未標記的Caerin 1.1更高，抑制腫瘤生長的效率更強[54]。Caerin 1.1和Caerin 1.9局部腫瘤注射可抑制小鼠TC-1腫瘤，小鼠B16黑色素瘤生長[49]。

6 Caerin多肽提高治療性疫苗療效

HPV16E7長肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗體皮下免疫加上腫瘤局部注射Caerin多肽可顯著增加TC-1荷瘤小鼠的存活時間[55]。與PBS處理的對照組相比，僅用EX/MPLA/抗IL-10R抗體進行免疫接種，或僅腫瘤局部注射caerin多肽進行免疫接種，不增加TC-1荷瘤小鼠的生存時間[55]。 此外，如果使用HPV16E7長肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗體皮下免疫加上腫瘤局部注射Caerin多肽， 聯(lián)合PD-1免疫檢查點抗體，可使40%的小鼠完全清除TC-1腫瘤，高于HPV16E7長肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗體皮下免疫加上腫瘤局部注射對照多肽(20%)。

7 Caerin多肽改善免疫微環(huán)境的機制

Caerin多肽除直接的細胞毒外，還募集更多的T細胞和NK細胞到腫瘤部位[56]。Caerin多肽抑制小鼠TC-1腫瘤生長需要特異性免疫系統(tǒng)的存在，因為Caerin1.1和Caerin1.9抑制TC-1腫瘤生長的作用在裸鼠消失[55]。Caerin多肽抑制腫瘤生長的機理可能是除了直接的細胞毒外，還促進腫瘤細胞分泌炎性因子，吸引免疫細胞到腫瘤組織，有可能改善了腫瘤微環(huán)境的對效應細胞的免疫抑制作用。

未經(jīng)治療的TC-1腫瘤、HPV16E7長肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗體皮下免疫，聯(lián)合PD-1免疫檢查點抗體，結合TC-1腫瘤局部注射Caerin多肽或對照多肽的TC-1腫瘤內(nèi)浸潤白細胞的數(shù)量和功能單細胞RNA測序(ScRNA sequencing)TC-1腫瘤組織內(nèi)可鑒定出19個細胞群。包括巨噬細胞，CD4+，CD8+，CD4+CD8+，CD4-CD8- T細胞，B細胞，NK細胞，中性粒細胞和抗原提呈細胞等。未治療組的巨噬細胞，占所有腫瘤組織內(nèi)白細胞的50%，Caerin治療組占47%，對照組42%。這些巨噬細胞可根據(jù)其基因表達的不同，分為六個群，從免疫抑制型M2，到免疫促進型巨噬細胞，分別為M2 MΦ,MHCIIhiMΦ, MΦ/DCs,Ear2hiMΦ, MΦ/NKT and TAMs巨噬細胞。未治療組含大量Arg+的M2巨噬細胞，與未治療和對照多肽治療組相比，Caerin多肽治療組Arg+的巨噬細胞量顯著減少，MHCIIhiandEar2hi巨噬細胞明顯增多。此外，Caerin多肽局部腫瘤注射和對照多肽治療性疫苗免疫和PD-1抗體治療顯著促進了CD8+T細胞腫瘤組織浸潤；而Caerin多肽治療組的CD8+T細胞表現(xiàn)出更強的免疫激活狀態(tài)，與對照多肽治療組比較，Cd8a,Cd8b1,Tox,Ifng,Prf1和Rgs16的表達顯著增高，CD8+T細胞中記憶T細胞和效應記憶T細胞明顯增多。Caerin治療的TC-1腫瘤組織中免疫刺激狀態(tài)的NK細胞也比對照多肽治療組明顯增多。B細胞在TC-1腫瘤模型中具有免疫抑制作用，與未治療組和對照多肽治療組相比，Caerin多肽治療組的B細胞幾乎消失，而B細胞在TC-1腫瘤模型中具有促進腫瘤生長的能力[57]。蛋白組學分析結果表明，stat1信號傳導通路介導的細胞凋亡和一氧化氮的產(chǎn)生。此外，蛋白質組與單細胞轉錄組的計算整合與Caerin多肽治療后免疫抑制性B細胞功能的失活一致。

8 結語與展望

HPV引起的相關疾病嚴重危害人類健康，急需研發(fā)新的有效治療手段。免疫治療HPV相關疾病是研究的熱點和發(fā)展方向。免疫時使用抗IL-10受體抗體或IL-10抑制肽暫時阻斷IL-10，可提高治療性疫苗誘導的T細胞反應，增加T細胞數(shù)量，延長生存時間。腫瘤微環(huán)境對治療性疫苗誘導產(chǎn)生的免疫細胞有抑制作用，使CTLs細胞不能充分發(fā)揮抗腫瘤效應。來自兩棲動物分泌物的合成Caerin多肽在體內(nèi)外具有廣譜的抗腫瘤效果。Caerin多肽性質極其穩(wěn)定，能夠通過Tec激酶信號傳導和LXR/RXR通路引起急性炎癥和誘導癌細胞凋亡，改善免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，重新激活免疫細胞靶向攻擊腫瘤，殺傷腫瘤細胞。對Caerin多肽改善腫瘤微環(huán)境的機理深入研究，研發(fā)控制釋放長效Caerin多肽有助于進一步提高其提高治療性疫苗的效率。