芥子酸對(duì)Aβ1-42致PC12細(xì)胞損傷的改善作用及對(duì)BDNF/TrkB/ERK信號(hào)通路的影響

薛迪 劉宇超 汪娜 劉學(xué)偉

中圖分類號(hào) R285;R741 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）10-1181-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.05

摘 要 目的：研究芥子酸對(duì)β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）誘導(dǎo)的大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞）損傷的改善作用，并探討其對(duì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）/酪氨酸激酶B（TrkB）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路的影響。方法：將PC12細(xì)胞分為空白組、模型組和芥子酸低、高劑量組（50、100 μmol/L）。除空白組外，其余各組均用2 μmol/L的Aβ1-42誘導(dǎo)細(xì)胞損傷;建模24 h后，藥物組加入相應(yīng)藥液，培養(yǎng)24 h。觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，檢測(cè)細(xì)胞存活率和細(xì)胞中BDNF mRNA的表達(dá)情況及其蛋白水平，以及TrkB、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白的表達(dá)情況，并計(jì)算p-ERK1/2與ERK1/2的比值（p-ERK/ERK比值）。結(jié)果：與空白組比較，模型組細(xì)胞突觸變短，細(xì)胞連接較松，貼壁性差，胞質(zhì)較暗淡，胞漿中有較多顆粒，細(xì)胞存活率以及細(xì)胞中BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量及其蛋白水平，TrkB、p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量和p-ERK/ERK比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，芥子酸高劑量組細(xì)胞病理變化明顯改善，細(xì)胞存活率以及細(xì)胞中BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量及其蛋白水平，TrkB、p-ERK蛋白的相對(duì)表達(dá)量和p-ERK/ERK比值均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：芥子酸可改善Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與激活BDNF/TrkB/ERK信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 芥子酸;阿爾茨海默癥;β-淀粉樣蛋白1-42;腦源性神經(jīng)生長因子;酪氨酸激酶B;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶

Effects of Sinapic Acid on Improving PC12 Cell Damage Induced by Aβ1-42 and BDNF/TrkB/ERK Signaling Pathway

XUE Di1，LIU Yuchao2，WANG Na3，LIU Xuewei4（1. School of Pharmacy，Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 2. Office of Academic Research， Qiqihar Medical University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China; 3. School of Basic Medicine，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China; 4. School of Mental Health，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To study the improvement effects of sinapic acid （SA） on PC12 cell damage induced by Aβ1-42， and to investigate its effect on brain-derived neurotrophic factor （BDNF） /tyrosine kinase B （TrkB） /extracellular signal-regulated kinase （ERK） signaling pathway. METHODS： PC12 cells were divided into blank group，model group， SA low-dose and high-dose groups （50， 100 μmol/L）. Except for blank group， cell damage was induced by Aβ1-42 in other groups; 24 h after modeling，administration groups were added with the corresponding solution and cultured for 24 h. Morphological changes of cells in each group were observed. Cell survival rate， mRNA expression and protein level of BDNF，protein expression of TrkB，ERK1/2 and phosphorylated ERK1/2 （p-ERK1/2） were detected. p-ERK/ERK ratio was calculated. RESULTS：Compared with blank group，the model group had shorter synapses，looser intercellular junctions，poor adhesion，dim cytoplasm and more granules in cytoplasm. Cell survival rate and mRNA expression and protein level of BDNF， the relative expression of TrkB and p-ERK1/2 protein， p-ERK/ERK ratio were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group，in SA high-dose group the pathological changes of the cells were significantly improved，the survival rate of the cells，the mRNA expression and protein level of BDNF，the relative expression of TrkB and p-ERK1/2 protein， p-ERK/ERK ratio were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS：SA can improve PC12 cells damage induced by Aβ1-42， the mechanism of which may be associated with activating BDNF/TrkB/ERK signaling pathway.

KEYWORDS? ?Sinapic acid; Alzheimers disease; Aβ1-42; Brain-derived neurotrophic factor; Tyrosine kinase B; Extracellular signal-regulated kinase

阿爾茨海默?。ˋD）是一種以認(rèn)知障礙為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1]。β-淀粉樣蛋白（Aβ）在腦內(nèi)過度累積形成的淀粉樣蛋白斑塊是AD的典型病理特征[2]。Aβ主要包括Aβ1-40和Aβ1-42兩種亞型，其中Aβ1-42在AD患者腦內(nèi)最具神經(jīng)元毒性，易引起老年斑的形成[2-3]。

目前，美國FDA批準(zhǔn)用于治療AD的藥物有兩類，一類是膽堿酯酶抑制劑，如多奈哌齊、加蘭他敏等;另一類是N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗藥，如鹽酸美金剛;但這兩類藥物均不能有效逆轉(zhuǎn)AD的進(jìn)程[4]。2019年11月，國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了治療AD的新藥——九期一?（甘露特鈉膠囊，GV-971）的上市申請(qǐng)，該藥的主要成分是海洋褐藻中的低分子酸性寡糖類化合物，能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群的靶向腦-腸軸而改善患者的認(rèn)知功能，從而治療輕中度AD[5]。由此可見，從天然藥物中尋找用于防治AD的有效成分是可行的。

芥子酸，又稱3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸，廣泛分布于水果、蔬菜、谷物中，其衍生物有芥子堿、丁香醛等。研究指出，芥子酸對(duì)AD、共濟(jì)失調(diào)、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病有一定的治療作用[6]。相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芥子酸作為一種神經(jīng)保護(hù)劑，能夠減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，并能夠改善紅藻氨酸引起的小鼠認(rèn)知障礙，提示該化合物可能對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性具有拮抗作用，但其作用機(jī)制不詳[7-8]。另有研究報(bào)道，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）與酪氨酸激酶B（TrkB）受體結(jié)合后，可使TrK受體二聚化，從而激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）/核糖體S6蛋白激酶（RSK）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）等下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng);BDNF將上游信號(hào)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，使部分核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化，對(duì)神經(jīng)元存活、突觸功能和突觸可塑性具有重要作用[9-10]?；诖?，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以BDNF/TrkB/ERK信號(hào)通路為研究切入點(diǎn)，探討芥子酸對(duì)Aβ1-42致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為開發(fā)防治AD的創(chuàng)新候選藥物提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括DL-CJ-2NDII Ⅱ型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、Series 8000型CO2培養(yǎng)箱和QuantStudio 5型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、M200 PRO型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）、CKX41- A32PH型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、AL204型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、5804R型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、C1000 Touch型基因擴(kuò)增儀和Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、S11-6-S型恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、LDZH-200KBS型高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）等。

1.2 主要藥品與試劑

芥子酸對(duì)照品（批號(hào)S30697，純度≥97%）購自上海源葉生物科技有限公司;Aβ1-42蛋白（批號(hào)bs-0107p）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基（改良型，貨號(hào)SH30809.01）購自美國HyClone公司;胎牛血清（批號(hào)04-007-1A）購自美國BI公司;大鼠BDNF酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)E30664）購自北京誠林生物科技有限公司;RIPA細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑（100×）、BCA蛋白濃度試劑盒、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)分別為P0013B、P1005、P0010S、P0018AS）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;磷酸酶抑制劑混合物（100×）（批號(hào)CW2383S）購自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司;十二烷基硫酸鈉（SDS）、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司;預(yù)染蛋白質(zhì)Maker（批號(hào)26616）購自加拿大Fermentas公司;胰蛋白酶、青鏈霉素混合液（100×）、噻唑藍(lán)（MTT）、脫脂奶粉（批號(hào)分別為TB150、P1400、M8180、D8340）均購自北京索萊寶科技有限公司;小鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號(hào)分別為151218、122826、122011）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔ERK1/2、TrkB多克隆抗體（批號(hào)分別為11257-1-AP、13129-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;兔磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）多克隆抗體（批號(hào)#4377）購自美國CST公司;總RNA提取試劑（RNAiso Plus）、PrimeScripTM RT reagent Kit（Perfect real time）試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH plus）試劑盒（批號(hào)分別為D9108A、RR037A、RR420A）均購自寶生物工程（大連）有限公司;PCR引物由上海生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)、合成;所用試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

2 方法

2.1 Aβ1-42溶液的制備

將1 mg的Aβ1-42溶解于221.5 μL的水中，制成濃度為1 000 μmol/L的溶液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h（培養(yǎng)條件下同），于-20 ℃保存，備用。

2.2 分組

根據(jù)課題組前期MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的最適濃度為2 μmol/L，芥子酸對(duì)PC12細(xì)胞損傷具有改善作用的濃度范圍為32～128 μmol/L。本研究將細(xì)胞分為4組，即空白組、模型組（Aβ1-42，2 μmol/L）和芥子酸低、高劑量組（50、100 μmol/L，以DMSO為溶劑）。

2.3 芥子酸對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活性影響的檢測(cè)

采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。收集對(duì)數(shù)期的PC12細(xì)胞，接種至96孔板中，每孔100 μL，使細(xì)胞密度為5×104 mL-1，按“2.2”項(xiàng)下方法分為4組，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置不含細(xì)胞的凋零組。各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，除空白組外，模型組和芥子酸低、高劑量組分別用終濃度為2 μmol/L的Aβ1-42作用24 h以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷;然后，芥子酸低、高劑量組加入相應(yīng)濃度的芥子酸繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將各組細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，采用MTT法以酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值）/（空白組OD值-調(diào)零組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 芥子酸對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中BDNF mRNA表達(dá)影響的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。按“2.3”項(xiàng)下方法接種、分組、造模、給藥，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于給藥培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，使用RNAiso Plus快速提取各組細(xì)胞總RNA;以RNA為模板，將PrimeScripTM RT reagent Kit和SYBR? Premix Ex TaqTM配合使用以逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）包括SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，40 個(gè)循環(huán)。BDNF上游引物為5′-AGGCTTGACATCATTGGCTGACAC-3′，下游引物為5′-GGCACTTGACTACTGAGCATCACC-3′，產(chǎn)物片段長度為135 bp;β-actin上游引物為5′-AGAGGCATCCTGACCCTGAAG-3′，下游引物為5′-GGTTGGCCTTAGGGTTCAGAG-3′，產(chǎn)物片段長度為128 bp。按2-ΔΔCT法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量，以空白組結(jié)果為“1”，計(jì)算其他各組的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 芥子酸對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中BDNF蛋白水平影響的檢測(cè)

采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。收集對(duì)數(shù)期的PC12細(xì)胞，接種至6孔板中，每孔1.5 mL，使細(xì)胞密度為10×104 mL-1，按“2.2”項(xiàng)下方法分為4組，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。按“2.3”項(xiàng)下方法造模、給藥。于給藥培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融使細(xì)胞破壞并釋放出胞內(nèi)成分，于4 ℃下以2 000 r/min離心20 min，取上清液，于-80 ℃保存，備用。采用ELISA法以酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞中BDNF水平。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 芥子酸對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中TrkB、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。按“2.3”項(xiàng)下方法接種、分組、造模、給藥，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于給藥培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，按照RIPA細(xì)胞裂解液-PMSF蛋白酶抑制劑-磷酸酶抑制劑體積比100 ∶ 1 ∶ 1配制細(xì)胞裂解液，每孔加入細(xì)胞裂解液100 μL提取細(xì)胞總蛋白，冰上裂解15 min后，以12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，采用BCA法測(cè)定總蛋白含量，加入5×Loading buffer于95 ℃下煮沸5 min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品加至丙烯酰胺（用SDS、APS、TEMED、水等配制）凝膠中，以恒流（電流60 mA）電泳分離，再以恒壓（電壓75 V，2 h）轉(zhuǎn)膜;用5%脫脂奶粉于37 ℃下封閉1 h，加入TrkB、ERK1/2、p-ERK1/2、β-actin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 400），于4 ℃過夜，用TBST溶液清洗3次，每次5 min;加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），于37 ℃下反應(yīng)1 h，用TBST溶液清洗3次，每次5 min;以ECL顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上曝光成像。采用Image Lab 4.0.1圖像分析軟件檢測(cè)蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以p-ERK1/2與ERK1/2的比值（簡寫“p-ERK/ERK”）表示ERK1/2磷酸化水平。以空白組結(jié)果為“1”，計(jì)算其他各組的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芥子酸對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活性的影響

倒置顯微鏡下，空白組細(xì)胞連接緊密，可見長短不一的突觸，部分突觸相互連結(jié)，細(xì)胞周圍有光圈且有立體感（圖1A）;模型組細(xì)胞突觸變短，細(xì)胞連接較松，貼壁性差，胞質(zhì)較暗淡，胞漿中有較多顆粒（圖1B）;芥子酸低劑量組細(xì)胞突觸有輕微損毀，突觸較模型組增多，細(xì)胞圓潤性增強(qiáng)，細(xì)胞碎片變少（圖1C）;芥子酸高劑量組細(xì)胞突觸相對(duì)模型組增多變長，細(xì)胞密集且光圈變明顯（圖1D）。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組細(xì)胞的OD值和存活率均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，芥子酸低、高劑量組細(xì)胞的OD值和存活率均有所升高，其中高劑量組顯著升高（P<0.01），詳見表1。

3.2 芥子酸對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中BDNF mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞中BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，芥子酸低、高劑量組細(xì)胞中BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量均有所升高，其中高劑量組顯著升高（P<0.01），詳見表2。

3.3 芥子酸對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中BDNF蛋白水平的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞中BDNF蛋白水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，芥子酸低、高劑量組細(xì)胞中BDNF蛋白水平均有所升高，其中高劑量組顯著升高（P<0.05），詳見表2。

3.4 芥子酸對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中TrkB、ERK? ? 1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞中TrkB、p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量和p-ERK/ERK比值均顯著降低（P<0.05），而ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量無明顯變化（P>0.05）。與模型組比較，芥子酸高劑量組細(xì)胞中TrkB、p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量和p-ERK/ERK比值均顯著升高（P<0.05），而ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量無明顯變化（P>0.05）;此外，芥子酸低劑量組細(xì)胞的上述指標(biāo)均無明顯變化（P>0.05），詳見圖2、表3。

4 討論

Aβ是誘發(fā)AD的關(guān)鍵病理產(chǎn)物，其中Aβ1-42可導(dǎo)致患者神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)突觸脫失、認(rèn)知記憶能力受損[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42可損傷神經(jīng)元信號(hào)通路，導(dǎo)致大鼠神經(jīng)突觸損傷及學(xué)習(xí)記憶障礙;同時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，AD患者血清中Aβ1-42水平顯著高于正常人群，且Aβ1-42異常與其輕度認(rèn)知障礙相關(guān)[12-15]。中藥遠(yuǎn)志可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，能夠保護(hù)神經(jīng)元、改善學(xué)習(xí)記憶功能[16]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，灌服遠(yuǎn)志乙醇提取物后，大鼠腦脊液成分中可檢測(cè)到芥子酸，且遠(yuǎn)志中寡糖酯和遠(yuǎn)志皂苷的部分成分（如西伯利亞遠(yuǎn)志糖A1、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志糖苷B、3，6′-二芥子?；崽?、黃花遠(yuǎn)志素A等）均含有芥子酸殘基或其前體代謝產(chǎn)物（相關(guān)內(nèi)容待另文發(fā)表），提示遠(yuǎn)志中含有或經(jīng)代謝可產(chǎn)生芥子酸，其可能是遠(yuǎn)志保護(hù)神經(jīng)元、改善學(xué)習(xí)記憶功能的重要成分之一。本實(shí)驗(yàn)通過Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，顯微鏡下可見損傷細(xì)胞突觸變短，細(xì)胞連接較松，胞質(zhì)較暗淡，胞漿中有較多顆粒，細(xì)胞存活率顯著降低;但經(jīng)100 μmol/L的芥子酸干預(yù)后，PC12細(xì)胞損傷明顯得到抑制，突觸明顯長于模型組，細(xì)胞密集且光圈明顯，細(xì)胞存活率也顯著升高。由此說明，Aβ1-42可抑制細(xì)胞生長，降低細(xì)胞活性，影響其正常形態(tài);而芥子酸能明顯抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，改善受損細(xì)胞的形態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞活性，提示芥子酸具有保護(hù)PC12細(xì)胞、拮抗Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的作用。

BDNF存在于大腦皮層、海馬等部位，主要參與合成突觸蛋白、促進(jìn)突觸連接，可增強(qiáng)突觸可塑性、提高突觸傳遞效率、促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育、修復(fù)神經(jīng)元損傷，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化等發(fā)揮重要作用，亦可改善患者的學(xué)習(xí)記憶障礙[17-18]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BDNF/TrkB信號(hào)通路的功能障礙可導(dǎo)致AD的發(fā)生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)AD模型大鼠腦內(nèi)BDNF水平下降;BDNF亦可以調(diào)節(jié)Aβ在大腦中的沉積，減少Aβ導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)元損傷[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42可抑制PC12細(xì)胞中BDNF蛋白水平及其mRNA的相對(duì)表達(dá)量;芥子酸可改善Aβ1-42導(dǎo)致的PC12細(xì)胞BDNF蛋白水平及其mRNA相對(duì)表達(dá)量的降低，表明芥子酸可通過提高BDNF水平來降低Aβ1-42的細(xì)胞毒性從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

目前研究認(rèn)為，BDNF發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)制可能是其與神經(jīng)細(xì)胞表面特異性TrkB受體相結(jié)合，刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并啟動(dòng)相關(guān)生物學(xué)反應(yīng)，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、增殖及突出可塑性起到關(guān)鍵作用[21]。研究指出，BDNF/TrkB信號(hào)通路的異?？梢鹫J(rèn)知障礙，多奈哌齊可通過激活該信號(hào)通路改善AD模型大鼠的認(rèn)知功能下降;此外，TrkB信號(hào)通路還能夠抑制中間神經(jīng)元內(nèi)皮質(zhì)抑制素的基因表達(dá)[22-24]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，向大鼠海馬組織注射Aβ1-42建立AD模型后，海馬中Aβ1-42含量明顯增加，TrkB蛋白表達(dá)明顯降低，海馬神經(jīng)元受損、調(diào)亡[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42可導(dǎo)致PC12細(xì)胞TrkB蛋白表達(dá)降低，推測(cè)可能是由于細(xì)胞中BDNF蛋白表達(dá)下降，引起其結(jié)合性受體TrkB蛋白表達(dá)受到抑制，Aβ1-42的細(xì)胞毒性效應(yīng)引起了失償反應(yīng);而經(jīng)芥子酸干預(yù)后，TrkB蛋白表達(dá)明顯升高，說明隨著BDNF蛋白水平的升高，其特異性結(jié)合受體TrkB蛋白的表達(dá)得以補(bǔ)償性升高，表明芥子酸可以通過上調(diào)TrkB蛋白的表達(dá)而拮抗Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

BDNF與TrkB結(jié)合可進(jìn)一步活化細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ERK1/2及PI3K/Akt等下游信號(hào)通路，調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放[26]。其中，ERK是學(xué)習(xí)和記憶形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的信號(hào)分子，主要在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，激活ERK信號(hào)通路后，經(jīng)三級(jí)級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步激活RSK，使得環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持產(chǎn)生重要作用[27-29]。相關(guān)研究證實(shí)，ERK通路被抑制后，神經(jīng)細(xì)胞活性也會(huì)下降，神經(jīng)功能損傷會(huì)隨之加重，提示ERK信號(hào)通路的激活與神經(jīng)保護(hù)有關(guān)[30]。本研究結(jié)果顯示，Aβ1-42使p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量及p-ERK/ERK比值均顯著降低;使用高劑量芥子酸干預(yù)后，p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量和p-ERK/ERK比值均顯著升高，說明Aβ1-42干擾了細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此外，模型組細(xì)胞中ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量不變，但p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量卻明顯降低;而芥子酸可通過促進(jìn)磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)激活ERK信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控上游BDNF/TrkB信號(hào)通路，促進(jìn)BDNF及其受體TrkB的表達(dá)，從而拮抗神經(jīng)細(xì)胞的損傷、提高神經(jīng)細(xì)胞活性。

綜上所述，芥子酸可改善Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與激活BDNF/TrkB/ERK信號(hào)通路有關(guān)。本研究可為芥子酸作為新的神經(jīng)元保護(hù)劑提供相關(guān)分子生物學(xué)依據(jù)，但其具體的作用靶點(diǎn)仍有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2020-12-14 修回日期：2021-04-20）

（編輯：鄒麗娟）