代謝組學(xué)在水產(chǎn)動(dòng)物毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

■陳天賜 李 玲 王小翠 郭 慧

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088）

近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物病理學(xué)、生理學(xué)、毒理學(xué)及水產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)等方面都有應(yīng)用[1-3]。在毒理學(xué)的研究中，傳統(tǒng)的毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)具有通量低、周期長(zhǎng)、敏感度低等不利因素[4]，隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)毒性脅迫時(shí)生物體內(nèi)的內(nèi)源性小分子代謝物也會(huì)發(fā)生顯著的變化[1]，代謝組學(xué)這種快速、高效的檢測(cè)技術(shù)逐漸在毒理學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。代謝組學(xué)應(yīng)用于毒理學(xué)技術(shù)研究的基本原理是當(dāng)毒性物質(zhì)脅迫生物體時(shí)，造成生物體內(nèi)代謝途徑中內(nèi)源性代謝物的變化，代謝組學(xué)的檢測(cè)技術(shù)能對(duì)生物體受到脅迫之后的細(xì)胞、組織或者整個(gè)生物體的各種代謝通路中涉及的化合物進(jìn)行定性定量分析，可以很好地證明生物體在受到毒性脅迫后細(xì)胞、組織或生物體受到的損害[4]。與基因組學(xué)不同對(duì)的是，代謝組學(xué)可以證明毒性物質(zhì)對(duì)生物體造成的最終影響，而且在不同的生物體中，基因的結(jié)構(gòu)和功能可能各不相同，但是代謝物在不同物種間結(jié)構(gòu)與功能是高度保守的[5]，例如丙酮酸、乳酸這些代謝物，無(wú)論是在人類、老鼠、植物中其結(jié)構(gòu)與功能都是一樣的，這也意味著代謝組學(xué)中相同的分析與計(jì)算工具可以適用于任何物種[6]。此外，代謝組學(xué)技術(shù)得到的信息不一定與我們?cè)囼?yàn)假設(shè)的結(jié)果有因果關(guān)系，可能是其他因素影響的結(jié)果，這也有利于我們從中發(fā)掘到一些新的信息[5]。

1 代謝組學(xué)分析技術(shù)

代謝組學(xué)常用的分析技術(shù)包括核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatog?raphy-mass spectrometry，GC-MS）三種[7]。Bloch等[8]和Purcell等[9]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)具有奇數(shù)核子（包括質(zhì)子和中子）的原子核置于磁場(chǎng)中，在外加特定頻率的射頻場(chǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生原子核吸收射頻場(chǎng)能量的現(xiàn)象，這就是核磁共振現(xiàn)象[10]，核磁共振吸收的大小不僅與原子核本身有關(guān)，而且與所受的磁場(chǎng)強(qiáng)度有關(guān)[11]。其中氫譜（1H-NMR）是目前廣泛應(yīng)用的核磁共振檢測(cè)技術(shù)[2]；1985年北京分析測(cè)試學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)暨展覽會(huì)國(guó)際會(huì)議上首次展出GC-MS聯(lián)用儀，此后，各種聯(lián)用技術(shù)在對(duì)復(fù)雜化學(xué)物質(zhì)分析過(guò)程中不斷發(fā)展[12]，其中色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（主要是LC-MS與GC-MS技術(shù)）結(jié)合了色譜高分離和質(zhì)譜高鑒別性能的優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)和醫(yī)藥研究的各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[13]。

2 代謝組學(xué)在水產(chǎn)動(dòng)物毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在水產(chǎn)動(dòng)物研究中的應(yīng)用主要是通過(guò)分析水產(chǎn)動(dòng)物受毒性物質(zhì)脅迫后組織、細(xì)胞或生物體中的代謝物隨時(shí)間的變化，確定毒性作用的靶器官和組織、毒性作用的過(guò)程和生物標(biāo)志物，以進(jìn)行毒性物質(zhì)作用機(jī)制研究或毒性評(píng)價(jià)[14]。

2.1 代謝組學(xué)在水產(chǎn)動(dòng)物重金屬毒性研究中的應(yīng)用

甲殼類動(dòng)物是漁業(yè)資源重要組成部分，是淺近海捕撈和養(yǎng)殖的重要對(duì)象。Ji等[15]對(duì)重金屬污染海域下的脊腹褐蝦（Crangon affifinis）進(jìn)行研究。1H-NMR分析表明，黃河入?？诤Ｓ蚣垢购治r丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺含量上升，可能與脊腹褐蝦的滲透調(diào)節(jié)相關(guān)，丙二酸、磷酸膽堿、AMP含量的變化可能與脊腹褐蝦能量代謝相關(guān)。萊州灣海域脊腹褐蝦氨基酸和其他滲透壓相關(guān)有機(jī)物的變化則證明重金屬污染對(duì)脊腹褐蝦滲壓調(diào)節(jié)的影響，ATP、AMP含量升高，葡萄糖含量的顯著降低，表明金屬污染引起能量消耗的增強(qiáng)，而乳酸含量的減少證明無(wú)氧呼吸的減弱，此外，也發(fā)現(xiàn)丙氨酸和精氨酸可以作為重金屬鎘(Cd)污染的生物標(biāo)記物，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和酪氨酸可以作為重金屬砷(As)污染的生物標(biāo)記物。Yu等[16]基于1HNMR的代謝組學(xué)對(duì)渤海金屬污染海域的三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）進(jìn)行研究，其中三個(gè)位點(diǎn)三疣梭子蟹Cd含量均超過(guò)了海洋生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一級(jí)，S3562位點(diǎn)Cu含量超過(guò)了海洋生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)。代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示三個(gè)位點(diǎn)中三疣梭子蟹支鏈氨基酸含量均處于較低水平，支鏈氨基酸在免疫細(xì)胞蛋白質(zhì)合成中起重要作用，因此，高濃度的Cd可能誘導(dǎo)了三疣梭子蟹的免疫響應(yīng)。S6151位點(diǎn)磷酸膽堿、丙二酸含量升高，乙酰乙酸含量下降，證明金屬污染影響三疣梭子蟹三羧酸循環(huán)和脂質(zhì)代謝。S6351位點(diǎn)ATP含量顯著上升，2-羥基戊二酸含量下降，可能是2-羥基戊二酸脫氫酶活性下降造成對(duì)ATP合成酶的抑制減弱，導(dǎo)致ATP含量的升高和糖原減少，此外，肌苷含量減少可能造成肌肉運(yùn)動(dòng)的減緩。S3562位點(diǎn)?；撬?、甘氨酸、龍蝦膽堿含量顯著升高，但是酪氨酸、組氨酸、苯丙氨酸等含量顯著的下降，可能是金屬脅迫下三疣梭子蟹通過(guò)降低氨基酸含量調(diào)節(jié)滲透平衡。Ding等[17]用GC-MS代謝組學(xué)研究慢性Pb暴露對(duì)日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）幼蝦的影響，發(fā)現(xiàn)氧代脯氨酸和賴氨酸含量較高，牛磺酸、鳥(niǎo)氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量較低，有相關(guān)研究認(rèn)為?；撬崤c抗氧化和線粒體代謝調(diào)控相關(guān)，而且Pb的毒性機(jī)制之一是氧化脅迫，因此，牛磺酸降低表明Pb脅迫引起了氧化應(yīng)激反應(yīng)。甘氨酸是發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，鳥(niǎo)氨酸是大腦中最豐富的氨基酸，因此，Pb脅迫也可能會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

魚(yú)類是最古老的脊椎動(dòng)物，存在于地球上大部分的水生環(huán)境中，因此水體污染極可能對(duì)水體中魚(yú)類動(dòng)物的健康造成影響。Cappello等[18]用以1H-NMR代謝組學(xué)方法研究Hg對(duì)金鮻（Liza aurata）鰓的毒性作用，代謝組學(xué)分析顯示肌酸、乳酸、丙氨酸濃度上升，甘油磷酸膽堿、還原性谷胱甘肽含量下降。鰓中肌酸含量的上升可能是生成更多Na+/K+-ATP以維持滲透壓的平衡，乳酸含量的上升證明在Hg脅迫下機(jī)體通過(guò)無(wú)氧呼吸產(chǎn)生更多的能量以維持機(jī)體正常代謝，丙氨酸可以將游離氨攜帶到肝臟中，丙氨酸含量上升可能是為了減少毒性脅迫下蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的大量游離氨基酸，甘油磷酸膽堿的顯著下降可能與細(xì)胞膜修復(fù)相關(guān)，還原性谷胱甘肽減少可能是作為抗氧化劑應(yīng)對(duì)Hg脅迫。Khan等[19]基于1H-NMR技術(shù)研究了Pb和Cd毒性作用下銀鯽（Carassius auratus gibelio）的血液代謝譜，Pb暴露的銀鯽血液丙氨酸、賴氨酸和酪氨酸顯著下降，Cd暴露后，賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸含量顯著下降，3-羥基丁酸、丙酮、乳酸、膽堿、肌苷、鳥(niǎo)苷和蘇氨酸含量增加，Pb和Cd共暴露時(shí)丙酮酸、鳥(niǎo)苷和肌苷含量的增加比單一毒性物質(zhì)暴露時(shí)更加顯著，結(jié)果證明Pb暴露影響銀鯽的神經(jīng)傳導(dǎo)與氨基酸代謝，此外，Pb或Cd暴露均能干擾能量代謝和滲透調(diào)節(jié)，Pb和Cd共暴露時(shí)對(duì)能量代謝的影響更加顯著。Steven等[20]運(yùn)用非靶向NMR技術(shù)研究了雨季與旱季兩個(gè)不同區(qū)域（正常水體和金屬Sb污染水體）食蚊魚(yú)（Gambusia holbrooki）的代謝物質(zhì)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)間地點(diǎn)采集的樣品代謝物種類相似，但是在旱季采集的樣品，金屬污染組代謝物的數(shù)量具有顯著的差異，金屬污染組大多數(shù)代謝物的含量上升，少數(shù)幾種與金屬結(jié)合、排泄、解毒等功能相關(guān)代謝物含量顯著下降，其中天冬氨酸、組氨酸、肌醇、?；撬岷湍憠A含量可以作為金屬毒性的生物標(biāo)記物。

軟體動(dòng)物因分布廣泛、易收集和對(duì)帶毒物質(zhì)耐受性強(qiáng)等特點(diǎn)常常用做環(huán)境檢測(cè)生物。Wu等[21]研究菲律賓蛤（Venerupis philippinarum）對(duì)金屬污染的生物監(jiān)測(cè)作用，測(cè)試了兩個(gè)家系的蛤?qū)Ｑ蠼饘貱d和Zn毒理學(xué)效應(yīng)，結(jié)果表明，在Cd或Zn脅迫下兩種蛤的代謝物之間具有顯著的差異，例如在Cd脅迫的白蛤中發(fā)現(xiàn)了支鏈氨基酸、脯氨酸和糖原增加，谷氨酸減少，而在斑馬蛤中卻發(fā)現(xiàn)了谷氨酰胺增加，精氨酸、乙酰乙酸和天冬氨酸減少。此外，在Zn脅迫下兩種蛤滲透調(diào)節(jié)相關(guān)代謝物（例如：?；撬帷喤；撬?、龍蝦膽堿）的變化也具有顯著的差異。這表明兩種蛤?qū)饘倜{迫具有不同的響應(yīng)機(jī)制。Zhang等[22]利用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究Cu對(duì)菲律賓簾蛤（Ruditapes philippi?narum）的毒性影響，結(jié)果顯示與滲透壓調(diào)節(jié)、檸檬酸循環(huán)相關(guān)的代謝物質(zhì)發(fā)生顯著的變化，例如龍蝦膽堿、支鏈氨基酸的增加，琥珀酸、丙氨酸和二甲胺含量減少，因此，Cu脅迫可能干擾菲律賓簾蛤滲透調(diào)節(jié)和能量代謝。Wu等[23]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方法對(duì)不同鹽度下As對(duì)菲律賓蛤（Ruditapes philippinarum）鰓的毒性作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)正常鹽度（31.1 psu）下As脅迫造成琥珀酸鹽和延胡索酸鹽水平上升，可能與鰓的能量代謝相關(guān)，中低鹽度（23.3 psu和15.6 psu）下甜菜堿濃度明顯的上升，可能是As脅迫造成對(duì)菲律賓蛤鰓的滲透壓的影響，低鹽度（15.6 psu）下As脅迫造成ATP和甜菜堿含量顯著上升，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和酪氨酸含量下降，可能與細(xì)胞能量代謝相關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析顯示ATP合成酶上調(diào)及琥珀酰-CoA合成酶和核苷二磷酸激酶的下調(diào)，表明As影響菲律賓蛤的能量代謝。代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析進(jìn)一步證實(shí)As脅迫影響菲律賓蛤鰓的能量代謝。Yu等[24]運(yùn)用NMR代謝組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究了亞砷酸鹽As（Ⅲ）和砷酸鹽As（Ⅴ）對(duì)貽貝（Mytilus galloprovincialis）的毒理學(xué)效應(yīng)，代謝組學(xué)分析表明As（Ⅲ）和As（Ⅴ）脅迫引起多類代謝物發(fā)生顯著改變，包括氨基酸、有機(jī)滲透物質(zhì)、能量?jī)?chǔ)存物質(zhì)，結(jié)果表明As（Ⅲ）和As（Ⅴ）可干擾貽貝滲透調(diào)節(jié)以及免疫應(yīng)激，As（Ⅴ）造成能量代謝的紊亂。蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)聯(lián)合分析進(jìn)一步證明了As（Ⅴ）脅迫下可以造成貽貝能量代謝的紊亂。

2.2 代謝組學(xué)在水產(chǎn)動(dòng)物其他毒性物質(zhì)研究中的應(yīng)用

除重金屬外，代謝組學(xué)技術(shù)也應(yīng)用到水體其他有毒有害物質(zhì)研究中（如表1）。例如有機(jī)農(nóng)藥、氨氮、抗生素等，代謝組學(xué)的分析結(jié)果顯示，這些水體污染物均在不同程度的影響水產(chǎn)動(dòng)物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的差異變化，透過(guò)差異代謝物的變化揭示了水體中毒性物質(zhì)的毒性機(jī)制，例如引起水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)免疫、抗氧化、滲透調(diào)節(jié)、能量代謝、細(xì)胞損傷等變化，進(jìn)而影響其健康生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物的死亡。

表1 近年關(guān)于代謝組學(xué)應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物毒理學(xué)研究的報(bào)道

表1（續(xù)）近年關(guān)于代謝組學(xué)應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物毒理學(xué)研究的報(bào)道

3 不足與展望

目前代謝組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物毒理學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，但還存在著一些不足：①代謝組學(xué)要求對(duì)代謝組中所有代謝物進(jìn)行分析，但是，目前沒(méi)有任何一種技術(shù)能對(duì)生物體內(nèi)所有的代謝物進(jìn)行檢測(cè)[49]；②代謝組學(xué)可以得到大量的信息，但是，缺乏相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，信息處理較為繁雜，因此，對(duì)這些信息處理的技術(shù)還是需要不斷地提高才能更好地研究代謝產(chǎn)物的變化是表征的生理或病理的變化[7]；③不同年齡階段、遺傳變異、動(dòng)物品系的代謝產(chǎn)物具有明顯的差異，這導(dǎo)致如何判斷生物體是發(fā)生了病理的變化還是生理的變化成為一個(gè)難題[50]；④當(dāng)機(jī)體的生理和藥理效應(yīng)超敏時(shí)受試物即使沒(méi)有相關(guān)毒性，也可能引起明顯的代謝變化，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[51]；⑤靈敏度和動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍方面具有一定的局限性，檢測(cè)的靈敏度受到檢測(cè)樣品量的影響[7]。但是，代謝組學(xué)技術(shù)快速、高效的特點(diǎn)是傳統(tǒng)毒理學(xué)檢測(cè)手段所不能比擬的，隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，在水產(chǎn)動(dòng)物毒理學(xué)研究中的應(yīng)用不斷成熟，代謝組學(xué)技術(shù)必定會(huì)為促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物毒理學(xué)研究做出重大貢獻(xiàn)。