飼用植物甘草粗提物HPLC特征圖譜的建立

■董 壯 1，2 劉夢婷 1，3 鐘曉紅 2 卿志星 1，3 雷寶珠 1 劉秀斌 1 曾建國

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，中獸藥湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

飼用植物是指農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相關(guān)文件批準(zhǔn)可以用于商品飼料生產(chǎn)的有一定應(yīng)用功能的植物，具體產(chǎn)品表現(xiàn)形式有以干燥粉或粗提物為基礎(chǔ)的飼料原料和以精提取物為基礎(chǔ)的飼料添加劑[1]。甘草作為一種傳統(tǒng)的中草藥，近年來發(fā)現(xiàn)其具有很高的飼用價值。中藥甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflate Bat.）或光果甘草（Glycyr?rhiza glabra L.）的干燥根和莖[2]含有多種化學(xué)活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、保護(hù)肝臟、改善心血管系統(tǒng)等一系列的重要功能[3]。同時甘草作為新型中草藥飼料添加劑具有提升動物生長性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，可以替代或者部分替代抗生素等化學(xué)合成添加劑，被廣泛應(yīng)用于山羊、綿羊、奶牛、家禽等的生產(chǎn)中，促進(jìn)了畜禽生產(chǎn)性能的提高和機(jī)體的改善[4]。

隨著市場對甘草及甘草粗提物需求的日益增加，野生資源的減少以及人工種植面積的增加，受地域、氣候、海拔和土壤等因素影響[5]，現(xiàn)有的甘草及其提取物的品質(zhì)評價方法已經(jīng)不能滿足甘草的品質(zhì)評價及資源綜合利用的需要[6]。此外甘草作為新型的中草藥飼料添加劑，其活性成分具有微量高效、成分復(fù)雜的特點(diǎn)，采用傳統(tǒng)的價值評定系統(tǒng)難以確定其有效成分和作用效果。指紋圖譜技術(shù)作為一種現(xiàn)代分析手段，常用以分析多維復(fù)雜問題，為飼料活性物質(zhì)的研究提供新思路[7]。因此應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)建立來自不同來源的34批甘草粗提物活性成分的特征圖譜，能夠從化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的角度考察甘草作為飼料添加劑的穩(wěn)定性和可靠性，具有專屬性、整體性、模糊性等特點(diǎn)[8]，可以較為全面地反映甘草中所含主要活性成分的種類和數(shù)量[9]。甘草中所含化學(xué)成分主要以三萜皂苷類和黃酮類為主，還有香豆素、生物堿。根據(jù)已有文獻(xiàn)報道，甘草中所含化學(xué)成分適宜使用高效液相色譜法（HPLC）測定[10]，故研究按照《中國獸藥典》通則中高效液相色譜法的要求建立分析方法，構(gòu)建飼用植物甘草粗提物的特征圖譜，為甘草的質(zhì)量評價提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；TG16-WS離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；KQ5200DE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；New Classic ME電子天平（METTLER TOLEDO）；色譜柱Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5μm)。

1.2 材料

無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，分析純）、乙腈（色譜純，Merck）；超純水（Milli-Q水系統(tǒng)）、磷酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純），甘草對照藥材、對照品甘草苷（190726-009，≥98%）、甘草酸（190504-006，≥98%）均購自北京中興嘉仁生物技術(shù)有限公司。

1.3 樣品

從亳州、安國、廉橋三地的藥材市場收集34批甘草樣品，并對其編號。經(jīng)鑒定，S10、S26為光果甘草，S13、S28為脹果甘草，其余均為甘草。詳細(xì)采購信息見表1。

表1 34批甘草詳細(xì)信息

1.4 色譜

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；以乙腈（A）和0.05%磷酸水（B）為流動相，梯度洗脫，0～15 min，10%～25%A；15～35 min，25%～50%A；35～60 min，50%～90%A；45～60 min，70%～100%A；體積流量為1 mL/min；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為30℃；檢測波長為276 nm；在以上的色譜條件下，各色譜峰分離效果最佳，基本達(dá)到基線分離。

1.4.2 樣品的前處理

將上述收集到得甘草樣品曬干粉碎，將甘草粉碎物過1號篩，取粉碎過篩后的甘草樣品100 g，用70%乙醇回流提取2次，每次1 h，溶劑加入量依次為分別用500 mL和800 mL，合并提取液，濾液減壓回收乙醇至稠膏狀，60℃烘干，即得。

1.5 溶液的制備

1.5.1 供試品溶液的制備

稱取樣品粉末約0.20 g，置25 mL具塞錐形瓶中，精密加入乙醇-水（70∶30）25 mL，密塞，超聲處理（功率400 W，頻率37 kHz）30 min，取出，放冷至室溫。取適量提取液于10 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min；取上清液用0.22μm濾膜過濾，取續(xù)濾液于液相色譜小瓶中，備用。

1.5.2 參照物溶液的制備

分別精密稱定甘草苷、甘草酸對照品各5.0 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，加乙醇-水（70∶30）超聲溶解定容至刻度，制成濃度為0.2 mg/mL的參照物儲備液，于4℃冷藏備用。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 精密度試驗

取S1樣品約0.20 g，精密稱定，按“1.5.1”項下方法制備供試品溶液，按照“1.4.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10μL，并記錄色譜圖。以3號峰為參照峰（S），8個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于0.2%和4%，說明該方法的精密度符合分析方法的要求。

1.6.2 穩(wěn)定性試驗

取S1樣品約0.20 g，精密稱定，按“1.5.1”項下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、3、4、5、6、12、24 h按“1.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以3號峰為參照峰，各特征峰以及S峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于0.5%和3%，說明該方法穩(wěn)定。

1.6.3 重復(fù)性試驗

精密稱定S1樣品6份，每份約0.20 g，按“1.5.1”項下方法制備供試品溶液，按照“1.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣，并記錄色譜圖。以3號峰為參照峰，各特征峰以及S峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于0.1%和5%，說明該方法的重復(fù)性滿足要求。

2 結(jié)果

2.1 特征圖譜的建立

將34批甘草粗提物樣品，按照“1.5.1”項下方法制備供試品溶液，按照“1.4.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。采用儀器自帶軟件將所有色譜圖疊加，根據(jù)疊加圖譜中色譜峰分布，選擇各批次共有色譜峰作為特征峰，建立統(tǒng)一處理方法處理各批次樣品色譜圖，確保每一批次特征峰均能被積分，再將色譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為*.AIA格式，將格式轉(zhuǎn)化后的文件導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年版）”將“時間窗寬度”設(shè)定為0.2，進(jìn)行多點(diǎn)校正。通過儀器自帶軟件和“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年版）”二次驗證，共有特征峰在34批樣品中均能識別，最后得到34批樣品疊加圖，并建立甘草粗提物特征圖譜的對照圖譜（R），詳見圖1和圖2。通過兩種方式，最終確定8個共有特征峰，按出峰時間依次標(biāo)記為1～8號峰。以上指認(rèn)特征峰均為甘草中有效成分，因此我們認(rèn)為建立的特征圖譜具有代表性，能對甘草粗提物進(jìn)行質(zhì)量控制[11]。

圖1 儀器自帶軟件（Empower 3）對34批甘草粗提物的手動疊加圖譜

圖2 34批不同來源的甘草粗提物的色譜疊加圖以及對照特征圖譜（R）

2.2 特征峰的指認(rèn)

經(jīng)文獻(xiàn)查閱，參考藥典，初步選定甘草苷、甘草酸為對照品，為考察特征圖譜是否具有代表性以及能否表征待測所含成分的專屬性，通過與對照品的HPLC譜圖比對，明確保留時間為15.78、24.19 min的色譜峰分別為甘草苷（3號峰）和甘草酸（5號峰），采用質(zhì)譜手段及對以往文獻(xiàn)的查閱，明確保留時間15.38 min的色譜峰為芹糖甘草苷（2號峰）。鑒于甘草苷為甘草的主要有效成分，峰強(qiáng)度高，且保留時間適中，因此設(shè)定其為參照物（S峰）；同時計算上述8個特征峰的相對保留時間（表2）和相對峰面積（表3）。結(jié)果顯示，各批次樣品特征峰的相對保留時間的RSD均在0.15%以下，說明特征峰出峰時間相對穩(wěn)定，一定程度上體現(xiàn)了其質(zhì)量的穩(wěn)定性；而相對峰面積結(jié)果顯示，各批次特征峰的峰面積差異較大，反映了不同來源批次甘草樣品的差異性，由于甘草樣品均采購自藥材市場，因此無法準(zhǔn)確從樣品來源進(jìn)行差異性分析。

表2 34批甘草粗提物特征圖譜中8個特征峰的相對保留時間

表3 34批次甘草粗提物特征圖譜中8個特征峰的相對峰面積

2.3 聚類分析

將34批甘草粗提物樣品的8個共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0軟件進(jìn)行聚類分析，以平方歐式距離為測量區(qū)間，采用系統(tǒng)聚類的方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[12]。結(jié)果顯示：34批樣品（除S32外）被分成4大類（如圖3）。S6、S9、S13、S22、S26為一類，S1～S2、S5、S23為一類，S3～S4、S7～S8、S10～S11、S14～S18、S21、S24～S25、S27～S28為一類，S12、S19～S20、S31為一類。由此分類可知，甘草品質(zhì)不具有明顯的地域性，盡管來自多地，但是內(nèi)在品質(zhì)較為均一。

圖3 聚類分析

3 討論

3.1 前處理優(yōu)化

為確保甘草粗提物主要成分最大限度地轉(zhuǎn)移到溶液中，便于樣品測定。由于甘草粗提物是經(jīng)70%乙醇回流提取、濃縮、干燥而得，其主要成分均易溶于70%乙醇中，因此選用70%的乙醇作為溶劑，并對溶劑的用量和提取方式進(jìn)行考察，三種不同提取方式分別為0.1、0.2、0.5 g甘草粗提物用25 mL 70%的乙醇提取。最終確定0.2 g甘草粗提物經(jīng)25 mL 70%乙醇超聲30 min，可全部溶解。

3.2 分離方法的優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇

取供試品溶液，分別考察了Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5μm)、Sunfire（4.6 mm×250 mm，5μm）、Di?amonsil（4.6 mm×250 mm，5μm）三根色譜柱對甘草中主要色譜峰分離的影響，評估了分離度、峰形、出峰時間等因素，結(jié)果表明不同色譜柱對分離效果影響不大，故該試驗選擇Unitary。

3.2.2 檢測波長的考察

本試驗采用二極管陣列檢測器（PDA）對樣品進(jìn)行全波長掃描，檢測結(jié)果多數(shù)色譜峰的最大吸收波長為276 nm，且在最大吸收波長下樣品測定結(jié)果中色譜峰數(shù)量及響應(yīng)程度均優(yōu)于其他波長，因此選擇276 nm作為數(shù)據(jù)采集波長。

3.2.3 流速的考察

流動相的流速越大，被分離物質(zhì)出峰時間越快，響應(yīng)高；較小的流速會造成分析時間過長，色譜峰展寬，造成拖尾、響應(yīng)變低等后果。考察不同流速對甘草粗提物中主要有效成分分離的影響，結(jié)果表明流速為1.2 mL/min時有部分成分未能完全分離，0.8 mL/min時分離效果與1.0 mL/min相近，但分離時間過長，故該流速為1.0 mL/min。

3.2.4 柱溫和的考察

考察柱溫25、30、35℃對甘草粗提物中主要有效成分分離的影響，結(jié)果表明不同柱溫對分離效果影響不大，故綜合考慮選擇柱溫30℃。

3.2.5 進(jìn)樣量的考察

考察進(jìn)樣量為3、5、10μL對甘草有效成分分離的情況，結(jié)果表明進(jìn)樣量為3μL和5μL時甘草粗提物有效成分色譜峰響應(yīng)偏低，故選擇10μL作為本試驗的進(jìn)樣量。

4 結(jié)論

本次試驗通過對前處理方法和儀器條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了良好的HPLC分析方法，使得甘草各化學(xué)成分在得到良好的分離，結(jié)合指紋圖譜技術(shù)對34批來自不同產(chǎn)地的甘草粗提物進(jìn)行了分析，得到了其容易識別、分離度較好的特征圖譜，各批次樣品圖譜中共包括8個特征峰，以3號峰為參照峰，同時計算共有峰的相對峰面積，并對結(jié)果進(jìn)行了聚類分析。通過與對照品色譜峰比對，并結(jié)合質(zhì)譜手段以及文獻(xiàn)查閱，確定了色譜峰2、色譜峰3和色譜峰5分別為芹糖甘草苷、甘草苷和甘草酸。本次研究構(gòu)建的34批不同產(chǎn)地的甘草粗提物的特征圖譜具有良好的精密性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于構(gòu)建基于產(chǎn)地差異的飼用植物品質(zhì)評價方法，是一種更高效的質(zhì)量控制的方法。此外，建立的HPLC分析方法結(jié)合指紋圖譜技術(shù)作為一種現(xiàn)代檢測手段，基本可實現(xiàn)對甘草中活性物質(zhì)的整體描述與評價，另外可在判別甘草的真?zhèn)蝺?yōu)劣以及綜合利用等方面提供一定的參考價值[13]。