硫酸亞鐵的添加量對棉籽粕中游離棉酚殘留的影響

■冉 函 1， 趙海兵 1 李 進 1 張 劍 1，* 劉永茵 1 劉雨倩 1 劉玉蘭

（1.武漢輕工大學，湖北省動物營養(yǎng)和飼料科學重點實驗室，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學化學與環(huán)境工程學院，湖北武漢 430023）

棉籽粕(CSM)是棉籽油料加工的主要副產(chǎn)物之一，粗蛋白含量豐富，可以作為畜禽飼料蛋白源[1-3]。然而，由于游離棉酚的存在，其應用受限[4-5]。游離棉酚（FG），一種多酚聯(lián)萘二醛的黃色化合物，廣泛分布于整個棉植株的色素腺體中[6]。畜禽攝入FG后，生長和生育能力受到抑制[7-8]。在研究棉酚對虹鱒魚毒性的試驗中，含95 mg/kg FG的日糧會引起虹鱒魚肝臟和腎臟的組織學變化；當FG增至290 mg/kg，虹鱒魚的生長受到抑制；繼續(xù)將FG含量增至531 mg/kg，虹鱒魚的體重下降，血細胞比容、血紅蛋白和血漿蛋白明顯減少[9]。由于含量低至100 mg/kg FG也能引起小牛中毒，所以，棉籽粕也不能用作小牛日糧的蛋白補充劑[10]。為了預防含有棉籽蛋白的配合飼料影響動物的生長與發(fā)育，2001年我國出臺了飼料的衛(wèi)生標準，明確規(guī)定了配合飼料中FG含量的安全限量。例如，對于肉用仔雞和生長雞、產(chǎn)蛋雞和生長育肥豬的飼料，每千克日糧中的FG含量相應不超過100、20 mg和60 mg[11]，其中，肉用仔雞和生長雞相同，均為100 mg，產(chǎn)蛋雞為20 mg，生長育肥豬為60 mg。

為了降低飼料的生產(chǎn)成本，進一步提高棉籽蛋白在飼料中的比例，在使用棉粕前，有必要采取某些措施以降低棉籽蛋白中游離棉酚（FG）含量。圍繞這一話題，科技工作者一直在尋找降低物料中游離棉酚殘留的方法。如：溶劑萃取法[12-13]、固態(tài)發(fā)酵法[14-15]、硫酸亞鐵法[16]等。在這些方法中，硫酸亞鐵價格低廉、來源廣泛，且能快速降低FG的含量而備受關注。2019年，棉籽粕脫毒深加工與利用課題組確認了5種棉酚鐵復合物的結構。其中，棉酚與Fe2+按1∶2摩爾比配位形成的化合物有2個，另外3種棉酚鐵化合物分別以1∶1，1∶3，1∶4摩爾比形成[17]。研究圓滿地解釋了非水溶劑中亞鐵離子與FG形成的復合物的結構，但是，對于水溶液中棉酚鐵復合物的穩(wěn)定性報道很少，而且，迄今為止國內(nèi)外尚未建立亞鐵離子的添加量與棉籽粕中游離棉酚殘留的關系。因此，研究棉籽粕中游離棉酚的殘留與亞鐵離子添加量的關系，不僅關系到被飼養(yǎng)動物的生長性能，而且還能對棉籽蛋白的合理利用提供理論指導。文章研究了硫酸亞鐵水溶液對棉籽粕中游離棉酚殘留的影響，同時，還探討了水溶液中棉酚鐵復合物的穩(wěn)定性，分析了結合棉酚轉化為游離棉酚的條件。該研究成果對棉籽粕的合理利用具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

棉籽粕（網(wǎng)絡購得，經(jīng)研磨機粉碎后收集，過60目篩的物料篩，混勻，備用。經(jīng)間苯三酚法分析后，該棉籽粕中的FG含量為1 156 mg/kg）；醋酸棉酚(GAA)為Sigma試劑；其他試劑（苯胺、間苯三酚二水合物等）均為國產(chǎn)分析純。7200型分光光度計（UNIC公司），pHS-3C型數(shù)字pH儀（上海INESA科學儀器有限公司），數(shù)顯水浴鍋（國華電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 含硫酸亞鐵的緩沖液制備

準確稱取一定量的七水硫酸亞鐵固體，溶于相應的緩沖溶液中，通過逐滴滴加鹽酸或氫氧化鈉將溶液酸度調(diào)至給定的pH值，定容。pH值為0.3、0.5、1.0和1.5的硫酸亞鐵溶液用0.2 mol/L的三氯乙酸-三氯乙酸鈉緩沖液配制；pH值為2.0，2.5，3.0，3.5的硫酸亞鐵溶液以0.2 mol/L的氯乙酸-氯乙酸鈉緩沖液配制；pH值為4.0、4.5、5.0、5.5的硫酸亞鐵用0.2 mol/L的HAC-NaAC緩沖液配制。

在試驗中，準確稱取棉籽粕500.0 mg(精確至0.1 mg)，加入2.0 mL含硫酸亞鐵的緩沖液，混勻。于一定溫度條件下水浴反應一段時間后，測定棉籽粕中游離棉酚的殘留。對于亞鐵離子添加量與棉籽粕中游離棉酚的摩爾比對游離棉酚殘留的影響試驗，反應酸度控制在pH 3.5，反應溫度和時間分別為25℃、2 h。在酸度、溫度和反應時間的試驗中，通過控制其他變量不變，改變一個單因素開展試驗。

1.2.2 棉籽粕中游離棉酚含量的測定

苯胺法是國內(nèi)外官方規(guī)定測定含棉籽粕干燥樣品中游離棉酚含量的方法。該法對游離棉酚定量的原理如下：游離棉酚與苯胺定量反應生成一種二苯胺棉酚的衍生物。該化合物的顯色反應需在沸水浴中熱處理30 min[18]。然而，經(jīng)過我們深入細致的研究后發(fā)現(xiàn)，該方法并不適用于硫酸亞鐵處理過的棉籽粕中的FG準確定量。因為沸水浴的熱處理，會將亞鐵離子快速氧化為紅色化合物，進而干擾二苯胺棉酚衍生物的比色測定。此外，在強酸性環(huán)境下苯胺與氫離子結合成苯胺鹽，使二苯胺棉酚衍生物的形成受到抑制。因此，苯胺法也不適用于強酸性環(huán)境下對棉籽粕中的游離棉酚準確定量。

干燥棉籽粕中的FG定量也常采用間苯三酚法[19]。其原理為：在高酸性的HCl介質(zhì)中，F(xiàn)G與間苯三酚試劑定量反應，生成的有色物質(zhì)在550 nm處有最大吸收，顏色深淺與FG含量呈正比，據(jù)此定量[20]。研究表明，該法反應條件溫和，分析樣品勿需高溫熱處理，能滿足對硫酸亞鐵處理過的棉籽粕中游離棉酚的定量要求。

準確稱取棉籽粕500 mg（精確至0.1 mg），加入2.0 mL含硫酸亞鐵的緩沖液，混勻。于一定溫度（如：25、30、35、40、45、50、55、60℃）水浴反應0.5～3 h，測定棉籽粕中F G殘留。在研究亞鐵離子添加量與棉籽粕中游離棉酚的摩爾比對游離棉酚殘留的影響試驗中，將酸度、溫度和反應時間分別控制在pH值3.5、25℃和2 h；在酸度試驗中，反應溫度和時間分別為25℃、2 h；在溫度試驗中，酸度和時間分別控制在pH值3.5、2 h；在考慮時間的影響試驗中，分別將酸度和溫度控制在pH值3.5、25℃。

2 結果與討論

2.1 亞鐵離子與棉籽粕內(nèi)游離棉酚的摩爾比

亞鐵離子添加量與棉籽粕中游離棉酚的摩爾比，是影響棉籽粕中游離棉酚殘留量的最重要因素之一。保持其他反應條件（反應酸度、溫度和時間分別為pH 3.5、25℃、2 h）不變，試驗了亞鐵離子的添加量對棉籽粕中游離棉酚殘留的影響（見圖1）。游離棉酚的殘留量隨硫酸亞鐵濃度的增加而逐漸減少，這是由于硫酸亞鐵與棉酚反應形成不溶于水的棉酚鐵復合物的緣故。當亞鐵離子與游離棉酚的摩爾比為5∶1時，棉籽粕中游離棉酚的殘留為854 mg/kg。進一步地將摩爾比提高至10、20、40、50、70、80倍，棉籽粕中的游離棉酚殘留量相應從1 156 mg/kg降至629、440、333、222、146 mg/kg和66 mg/kg?？紤]到棉籽粕中的其他有機成分(如植酸、單寧、蛋白質(zhì)等)也能與亞鐵離子結合，硫酸亞鐵的實際添加量要遠高于理論值。動物試驗表明，用硫酸亞鐵晶體處理棉籽粕，按4∶1的亞鐵離子對游離棉酚的重量比加料，能抑制蛋黃變色[21]。該劑量相當于亞鐵離子對游離棉酚的摩爾比為37∶1加料，所對應的棉籽粕中游離棉酚含量為400 mg/kg以下。因此，在生產(chǎn)含棉籽蛋白的合成飼料時，既要考慮被飼養(yǎng)的動物對游離棉酚忍受性的差異，也要兼顧飼料的適口性，以及被飼養(yǎng)動物的生長性能等因素，將硫酸亞鐵的添加量控制在一個合理范圍。

圖1 Fe2+與FG摩爾比對FG殘留的影響

2.2 酸度

酸度是影響棉籽粕中游離棉酚殘留的最主要因素。酸度直接關系到結合棉酚的穩(wěn)定性以及棉酚鐵復合物的形成。酸度對棉籽粕中游離棉酚殘留的影響見圖2。當pH≤2.0時，棉籽粕或者經(jīng)亞鐵鹽處理過的棉籽粕中游離棉酚的殘留量隨反應初始酸度的增加而迅速增加，這是由于部分結合棉酚轉化為游離棉酚的緣故，該結果與之前的報道一致[22]。在酸性條件下棉酚-蛋白可降解為游離棉酚和蛋白。由此可以預見，當含有棉籽粕的飼料通過單胃動物的胃時，極少量的結合棉酚在胃酸（pH值1.8）的作用下轉化為游離棉酚，進而使生物體內(nèi)的游離棉酚含量略有提高。此外，由于亞鐵離子與游離棉酚結合要釋放出氫離子，導致棉酚鐵復合物的形成受到抑制。這與Zhang等[17]研究的棉酚鐵復合物的形成需要釋放氫離子的結果相符。因此，高酸性環(huán)境對降低棉籽粕中的游離棉酚殘留不利。當pH≥2.0時，未經(jīng)亞鐵鹽處理的棉籽粕，其游離棉酚殘留受酸度的變化影響小，這表明：在pH值≥2.0時結合棉酚的穩(wěn)定性好，難以分解成游離棉酚。然而，酸度的變化對經(jīng)硫酸亞鐵處理后的物料中的游離棉酚殘留影響較大。在2≤pH值≤3.5的范圍內(nèi)，棉籽粕中的游離棉酚呈下降趨勢，且在pH值3.5時降至最低，這是由于該酸性環(huán)境是硫酸亞鐵在水溶液中存在的最穩(wěn)定形式。當物料的pH值=4.0時，游離棉酚殘留量較pH值3.5時有所反彈。此后，隨著物料酸度降低，棉籽粕中的游離棉酚殘留逐漸下降。這是由于低酸度環(huán)境能促進游離棉酚分子中的酚羥基解離，利于棉酚鐵復合物形成。總體來講，在給定的酸度下，經(jīng)硫酸亞鐵處理過的棉籽粕物料中的游離棉酚殘留要比對照低，而且，隨著亞鐵鹽補充量增大，游離棉酚的殘留也越低。

圖2 酸度對FG殘留的影響

2.3 反應時間

反應時間是降低棉籽粕中游離棉酚殘留的另一關鍵因素。反應時間對游離棉酚殘留的影響見圖3。當反應時間介于0.5～2.0 h時，游離棉酚的殘留量隨時間的延長而減少，在2 h時降至最低。繼續(xù)延長反應時間，對棉籽粕中游離棉酚殘留的降低貢獻不大?？梢?，較短的作用時間，導致亞鐵離子和游離棉酚之間的化學反應不充分，出現(xiàn)高殘留的游離棉酚現(xiàn)象。2 h后，棉酚鐵復合物的形成達到平衡狀態(tài)。因此，反應時間設定為2 h較為合理。

圖3 時間對棉籽粕中FG殘留的影響

2.4 反應溫度

溫度是影響化學反應速率的一個重要因素。溫度對物料中的游離棉酚殘留的影響見圖4。由圖4不難得出，低溫利于減少棉籽粕中游離棉酚的殘留量，這說明棉酚鐵復合物的形成是一個放熱過程。在實際脫毒過程中，一般選用常溫條件下操作，即將一定量的七水硫酸亞鐵晶體添加至棉粕中，充分混勻。在飼養(yǎng)動物前1～2 h，補加適當?shù)乃?，調(diào)和完畢后，再供動物飼用。

圖4 溫度對棉籽粕中FG殘留的影響

3 結論

向棉籽粕中補充硫酸亞鐵，利于減少游離棉酚的殘留。棉酚鐵復合物的形成為放熱過程，2 h的反應能形成穩(wěn)定的棉酚鐵復合物。另外，高酸性環(huán)境能抑制棉酚鐵復合物的形成，同時還會導致部分結合棉酚轉化為游離棉酚。