枯草芽孢桿菌ANSB01G對(duì)采食玉米赤霉烯酮污染日糧仔豬中毒癥狀的緩解效果

■雷元培 1 王利通 2 王國(guó)水 2 路則慶 1 計(jì) 成 3 汪以真

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江杭州 310058；2.浙江天蓬畜業(yè)有限公司，浙江江山 324109；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）又稱(chēng)F-2毒素，是由谷物副產(chǎn)品和其他常見(jiàn)食物中的鐮刀菌真菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的非甾體雌激素霉菌毒素[1]，是嚴(yán)重威脅食品安全和飼料安全的生物毒素之一。因ZEA在結(jié)構(gòu)上與雌激素非常相似，所以其在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)與雌激素受體（ER）結(jié)合，激活雌激素反應(yīng)元件，引發(fā)一系列的類(lèi)似雌激素的效應(yīng)，從而導(dǎo)致動(dòng)物生殖生理相關(guān)疾病的發(fā)生[2]。豬是對(duì)ZEA的雌激素效應(yīng)最敏感的動(dòng)物，其典型中毒癥狀有陰戶腫大、陰道和直腸脫垂以及乳腺增大，母豬的不孕、流產(chǎn)和假發(fā)情等[3-5]。此外，ZEA還具有肝臟毒性[6]、免疫毒性[7]、遺傳毒性[8]及細(xì)胞毒性[9]。

目前全世界大量谷物和飼料都受到霉菌毒素的污染，這給食品安全和畜牧養(yǎng)殖都帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。因此，亟需尋求一種安全有效的解決霉菌毒素的方法。目前，去除霉菌毒素的方法主要有傳統(tǒng)的物理化學(xué)法、吸附劑吸附法及生物降解法。傳統(tǒng)的物理化學(xué)法不僅影響飼料適口性，且其效果不穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)成分損失大、不能在實(shí)際生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[10]，吸附劑吸附法目前應(yīng)用較多，但有報(bào)道其只能吸附具有特定結(jié)構(gòu)的霉菌毒素，且會(huì)影響飼料中維生素和微量元素的吸收。生物降解法降解率高、專(zhuān)一性強(qiáng)、安全性高，越來(lái)越受到研究者的關(guān)注[11]。研究發(fā)現(xiàn)，由枯草芽孢桿菌ANSB01G經(jīng)過(guò)商業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮生物降解劑可以有效地降解玉米赤霉烯酮，減輕動(dòng)物的中毒癥。試驗(yàn)以玉米赤霉烯酮污染日糧為材料，研究其對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以及玉米赤霉烯酮生物降解劑對(duì)其中毒癥狀的緩解效果，為該降解劑在玉米赤霉烯酮霉變?nèi)占Z中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌ANSB01G由河南億萬(wàn)中元生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物與管理

試驗(yàn)選用體重均勻的55日齡杜×長(zhǎng)×大三元雜交斷奶母仔豬40頭，分為3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。各處理間初始體重差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)開(kāi)始前全豬舍清掃并消毒，試驗(yàn)期間每天清糞后消毒，豬只自由采食和飲水。試驗(yàn)期28 d。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組飼喂正常玉米型日糧，試驗(yàn)組1飼喂正常玉米型日糧+枯草芽孢桿菌ANSB01G（1 kg/t，活菌數(shù)為1×109CFU/g），試驗(yàn)組2飼喂玉米赤霉烯酮污染型日糧（ZEA含量為350μg/kg），試驗(yàn)組3在試驗(yàn)組2的基礎(chǔ)上添加1 kg/t的枯草芽孢桿菌ANSB01G。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，表2為飼料中霉菌毒素實(shí)測(cè)值。試驗(yàn)日糧使用豬場(chǎng)基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平。參照GB/T 23504—2009《食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法》的方法進(jìn)行飼料和原料中ZEA測(cè)定，并根據(jù)試驗(yàn)情況進(jìn)行調(diào)整。

表1 試驗(yàn)日糧與分組

表2 飼料中霉菌毒素實(shí)測(cè)值（μg/kg）

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

①生長(zhǎng)性能指標(biāo)：試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束分別對(duì)豬進(jìn)行稱(chēng)重，并記錄采食量和剩料量。根據(jù)以上數(shù)據(jù)計(jì)算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料重比（FCR）。

②陰戶指標(biāo)：試驗(yàn)開(kāi)始后每天觀察豬只陰戶腫脹情況，每周測(cè)量豬只陰戶腫脹情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量陰戶長(zhǎng)（a）、寬（b），并計(jì)算陰戶表面積（S）。比較各組豬只的陰戶增大及恢復(fù)效果。

S=（π×a×b）/4

③內(nèi)臟器官和繁殖器官指數(shù)：試驗(yàn)結(jié)束前12 h，每個(gè)組隨機(jī)抽取3頭豬空腹，然后屠宰。屠宰后剝離心臟、肝臟、腎臟、脾臟以及生殖器官（陰道+子宮角+卵巢）并稱(chēng)重，計(jì)算器官指數(shù)。

器官指數(shù)=器官重量（g）/活體重量（kg）

④血液生化指標(biāo)：血清及肝臟中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量均采用試劑盒測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

⑤血清激素指標(biāo)：試驗(yàn)結(jié)束前12 h，所有豬空腹，屠宰前進(jìn)行耳緣靜脈采血，分離出血清，放入-20℃的冰箱保存。用于檢測(cè)血液生化指標(biāo)和血清中雌二醇（E2）、孕酮（Prog）、睪酮（T）、促卵泡激素（FSH）、促黃體素（LH）含量和催乳素（PRL）含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SAS 9.0軟件的GLM程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為顯著水平，方差分析結(jié)果顯著時(shí)進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌ANSB01G對(duì)采食玉米赤霉烯酮污染日糧母仔豬生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表3）

表3 不同處理對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

表3試驗(yàn)結(jié)果顯示，28 d的試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)照組與各試驗(yàn)組間平均日增重、平均日采食量和料重比均未出現(xiàn)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明斷奶仔豬采食含有350μg/kg玉米赤霉烯酮的日糧時(shí)，其生長(zhǎng)性能并未受到顯著影響。

2.2 枯草芽孢桿ANSB01G菌對(duì)采食玉米赤霉烯酮污染日糧母仔豬陰戶面積的影響（見(jiàn)圖1）

由圖1可見(jiàn)，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，各組間母仔豬陰戶面積均無(wú)顯著差異。隨著飼喂天數(shù)增加，試驗(yàn)第7、14、21、28 d，試驗(yàn)組1仔豬陰戶面積始終與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)組2仔豬陰戶面積明顯高于對(duì)照組和試驗(yàn)組1（P＜0.05）。試驗(yàn)組3仔豬陰戶面積明顯小于試驗(yàn)組2，并有逐漸向?qū)φ战M接近的趨勢(shì)，說(shuō)明試驗(yàn)組3由于添加枯草芽孢桿菌ANSB01G的作用使仔豬外陰腫大得到顯著改善（P＜0.05）。

圖1 不同處理對(duì)母仔豬陰戶面積的影響

2.3 枯草芽孢桿菌ANSB01G對(duì)采食玉米赤霉烯酮污染日糧母仔豬器官指數(shù)的影響（見(jiàn)表4）

表4結(jié)果顯示，對(duì)照組與各試驗(yàn)組間心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05），試驗(yàn)組2繁殖器官指數(shù)顯著高于其他組（P＜0.05），試驗(yàn)組3繁殖器官指數(shù)明顯小于試驗(yàn)組2，與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明玉米赤霉烯酮影響仔豬的繁殖器官，添加枯草芽孢桿菌ANSB01G之后使仔豬的繁殖器官得到明顯改善。

表4 不同處理對(duì)仔豬器官指數(shù)的影響(g/kg)

2.4 枯草芽孢桿菌ANSB01G對(duì)采食玉米赤霉烯酮污染日糧仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表5）

表5結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組之間仔豬血清抗氧化指標(biāo)MDA含量和SOD、GSH-Px活性均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表5 不同處理對(duì)仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 枯草芽孢桿菌ANSB01G對(duì)采食玉米赤霉烯酮污染日糧仔豬血清雌激素的影響（見(jiàn)表6）

表6結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，仔豬血清中LH、FSH、PT、Prog、E2水平均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但試驗(yàn)組2中PRL水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)組3在試驗(yàn)組2基礎(chǔ)上添加枯草芽孢桿菌ANSB01G后，可以維持血清PRL水平達(dá)到正常對(duì)照水平。

表6 不同處理對(duì)仔豬血清雌激素的影響

3 討論

本試驗(yàn)研究了枯草芽孢桿菌ANSB01G對(duì)采食ZEA污染日糧斷奶母仔豬的作用效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中ZEA的含量為368.38μg/kg時(shí)，對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能沒(méi)有產(chǎn)生顯著的影響，這與其他研究者的研究結(jié)果一致。Jiang等[12]在斷奶仔豬日糧中添加1.05 mg/kg的ZEA，飼喂22 d后，仔豬生長(zhǎng)性能沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異。趙虎[13]研究報(bào)道在日糧中添加1～3 mg/kg的ZEA對(duì)仔豬的平均日增重和料重比也無(wú)顯著影響。Marcela等[14]在仔豬飼糧中添加3 mg/kg的ZEA，對(duì)斷奶仔豬的采食量、平均日增重及料重比并無(wú)顯著影響。

豬ZEA中毒可引起陰戶腫大、陰道和直腸脫垂等[3-5]。Letícia等[15]在雌性仔豬日糧中添加0.75 mg/kg ZEA，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組7 d便出現(xiàn)陰戶紅腫，到21 d時(shí)，其陰戶面積和生殖道增重均顯著增高。趙虎[13]研究報(bào)道在日糧中添加1～3 mg/kg的ZEA可以導(dǎo)致仔豬陰戶腫大，顯著增加仔豬陰戶面積，且顯著提高了仔豬生殖器官重量和生殖器官指數(shù)。Jiang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加不同濃度的ZEA均會(huì)引起仔豬陰戶腫大，其長(zhǎng)寬高和面積水平均顯著高于對(duì)照組，且陰戶面積的增大速度隨著ZEN濃度的升高逐漸加快。馬姍姍等[17]發(fā)現(xiàn)ZEA污染日糧可以引起青年母豬陰戶腫大，且在霉變?nèi)占Z中添加枯草芽孢桿菌ANSB01G可以改善陰戶腫大癥狀，使其恢復(fù)正常水平。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬日糧中ZEA含量為368.38μg/kg時(shí)，即可引起仔豬陰戶紅腫，生殖器官指數(shù)顯著增加，而在ZEA污染日糧中添加枯草芽孢桿菌ANSB01G，能顯著改善仔豬陰戶紅腫癥狀和生殖器官指數(shù)的增加，使其達(dá)到正常對(duì)照組水平。

自由基反應(yīng)對(duì)于機(jī)體防御機(jī)制是必要的，正常情況下機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡狀態(tài)。研究報(bào)道，ZEA可以誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，打破動(dòng)物機(jī)體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，引起疾病的發(fā)生[18]。姜淑貞[19]在飼糧中添加2.0 mg/kg和3.2 mg/kg ZEA飼喂斷奶仔豬后，試驗(yàn)組仔豬血清中GSH-Px的活性顯著低于對(duì)照組。楊立杰等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加0.5 mg/kg ZEA可以引起小母豬血清的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使血清GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高，且二者隨飼糧ZEA水平升高呈一次線性變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中ZEA含量為368.38μg/kg時(shí)，對(duì)斷奶仔豬血清MDA含量和SOD、GSH-Px活性均無(wú)顯著影響，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)所用日糧ZEA含量低，且試驗(yàn)期較短，在短時(shí)間內(nèi)不足以顯著影響血清MDA含量和SOD、GSH-Px活性。

ZEA在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)與雌激素受體（ER）結(jié)合，從而激活雌激素反應(yīng)元件，引發(fā)一系列的類(lèi)似雌激素的效應(yīng)[2]。Diekman等[21]在仔豬日糧中添加ZEA純品飼喂后，試驗(yàn)組仔豬LH分泌量顯著低于對(duì)照組，F(xiàn)SH的水平無(wú)顯著差異。Wang等[22]在日糧中添加ZEA飼喂后，使得仔豬的E2和LH水平降低，但試驗(yàn)組與對(duì)照組間的FSH水平?jīng)]有顯著差異。Jiang等[12]也報(bào)道斷奶仔豬日糧中ZEA含量為1.05 mg/kg時(shí)，可引起仔豬血清中E2含量顯著降低，而添加4 g/kg改性蒙脫石組E2水平則與對(duì)照組無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，斷奶仔豬日糧中ZEA含量為368.38μg/kg時(shí)，可引起血清中PRL水平顯著增加，但是對(duì)LH、FSH、PT、Prog、E2水平?jīng)]有顯著影響。而在ZEA污染日糧中添加枯草芽孢桿菌ANSB01G，能使血清中PRL維持正常水平。

4 結(jié)論

日糧中含有368.38μg/kg的ZEA，對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和血清抗氧化指標(biāo)沒(méi)有產(chǎn)生顯著的影響，但引起仔豬陰戶紅腫，生殖器官指數(shù)顯著增加，而在ZEA污染日糧中添加枯草芽孢桿菌ANSB01G，能顯著緩解這些中毒癥狀。同時(shí)，斷奶仔豬采食此ZEA污染日糧，可引起血清中PRL水平顯著增加，但是對(duì)LH、FSH、PT、Prog、E2水平?jīng)]有顯著影響，在ZEA污染日糧中添加枯草芽孢桿菌ANSB01G可使血清中PRL維持正常水平。