小麥赤霉病菌拮抗菌XG-6的分離鑒定及其應(yīng)用

馬東方, 盧濤, 詹闖, 金瑩瑩

1.主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(長江大學(xué))，湖北 荊州 434025 2.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025

在我國，小麥赤霉病是一種由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)引發(fā)的禾谷類作物重要病害[1,2]。禾谷鐮刀菌為半知菌亞門真菌，是一種常見的鐮刀菌[3-5]。因為喜溫喜潮濕的生長習(xí)性，由其內(nèi)膜導(dǎo)致的赤霉病也廣泛分布于全球溫暖潮濕半潮濕的地區(qū)[6,7]。我國華中地區(qū)和華南地區(qū)氣候相對潮濕，十分適合禾谷鐮刀菌的生存繁殖，因此在長江中下游和江淮地區(qū)的小麥種植地區(qū)小麥赤霉病的發(fā)生尤為嚴(yán)重[8]。最近幾年，已有報道小麥赤霉病向北蔓延的趨勢有所增加，在我國西北和東北等地常有發(fā)生[9,10]。而且，隨著小麥機(jī)械收割技術(shù)的不斷提高，小麥赤霉病的發(fā)生次數(shù)更加頻繁，發(fā)病程度愈發(fā)嚴(yán)重[11,12]，對我國麥類作物生產(chǎn)產(chǎn)生巨大影響。小麥赤霉病在我國的發(fā)病比例已高達(dá)25%，我國各地小麥產(chǎn)區(qū)深受小麥赤霉病危害[13,14]。小麥赤霉病主要在開花期侵染小麥穗部，灌漿期致病，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量與質(zhì)量，一般使小麥減產(chǎn)40%～60%[15]。禾谷鐮刀菌在侵染過程中會產(chǎn)生主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)等毒素類的單端胞霉烯族毒素(trichothecenes)，且主要累積在小麥的麥粒中[16]，嚴(yán)重影響小麥的品質(zhì)，甚至危害人畜健康[17,18]，嚴(yán)重時可致人畜死亡[19,20]。上述研究指出DON會導(dǎo)致小鼠中的核糖毒性應(yīng)激反應(yīng)，對暴露于DON的動物產(chǎn)生負(fù)面影響，對人畜造成危害[21-23]。

目前，田間管理與化學(xué)農(nóng)藥的使用是防治病蟲草害的主要手段，但化學(xué)藥劑的長期單一化使用造成了一系列不良后果，如抗藥性增強(qiáng)、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等[24]。生物防治在解決這些問題方面發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[25]。通過篩選針對小麥赤霉病的高效拮抗菌株研發(fā)生物防治藥劑成為研究熱點。芽胞桿菌因為其適應(yīng)性強(qiáng)、應(yīng)用潛力大[26]，在病害生物防治研究中已經(jīng)取得顯著成果[27]。國內(nèi)外學(xué)者已有許多關(guān)于小麥赤霉病的生防研究，篩選到的對禾谷鐮刀菌有拮抗作用的菌株多以芽胞桿菌、假單胞菌、放線菌等為主。在CHRISTIAN等[28]的研究中，生防細(xì)菌與氧化鋅納米粒子結(jié)合后可顯著抑制禾谷鐮刀菌的生長繁殖；HERRERA等[29]分離得到芽胞桿菌菌株5c，通過形成生物膜對赤霉病菌具有明顯的拮抗作用。HE等[30]從土壤中分離出小麥赤霉病的拮抗菌株，可使赤霉病病害程度顯著下降；ZHAO等[31]分離鑒定所得的菌株SG6(枯草芽胞桿菌)對禾谷鐮刀菌病菌胞子的萌發(fā)抑制率高達(dá)95.6%；李峰等[32]從小麥中分離得到HB022菌株屬于多黏類芽胞桿菌，對小麥赤霉病有顯著的防治效果；裴韜等[33]得到了枯草芽胞桿菌P72，在其細(xì)胞液中分離出的拮抗物質(zhì)可顯著抑制禾谷鐮刀菌生長；辛海峰等[34]分離得到對赤霉病具有較高防治作用的萎縮芽胞桿菌菌株XM；冉軍艦等[24]從田間土壤中分離出禾谷鐮刀菌拮抗芽胞桿菌菌株7M1。上述研究表明，利用植株內(nèi)分離得到的真菌對小麥赤霉病進(jìn)行生物防治具有較高的應(yīng)用潛力和可行性。

筆者以湖北荊州市荊州區(qū)農(nóng)高區(qū)小麥赤霉病發(fā)病地區(qū)揚花期健壯的小麥植株為試驗材料，分離、篩選材料的內(nèi)生菌，最終得到拮抗效果較強(qiáng)的內(nèi)生菌XG-6，并對其拮抗譜、耐藥性等進(jìn)行了研究，旨在為利用該拮抗菌株生物防治小麥赤霉病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植株與取樣方法

選取湖北省荊州市發(fā)生小麥赤霉病田塊中的健壯小麥，采用5點取樣法整株取樣，將整株小麥樣品放入無菌袋中保存，帶回實驗室分離內(nèi)生菌。

1.2 供試植物病原菌

供試的植物病原菌均由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病原真菌與基因組學(xué)研究室提供，菌株包括禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、火龍果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、白絹病菌(Sclerotiumrolfsii)和梨黑斑病菌(Alternariakikuchiana)。

1.3 內(nèi)生菌的分離

將小麥的莖和葉剪成5cm左右的小段，與穗粒一起，用水沖洗30min。以下操作均需要在超凈工作臺進(jìn)行。將小麥各部位切成0.5cm×0.5cm的組織塊，用75%酒精(乙醇)消毒1min，然后用4%次氯酸鈉消毒3min，再次用75%酒精(乙醇)消毒30s，最后用ddH2O清洗3遍，置于已滅菌的濾紙上吸干，每皿6塊組織塊均勻放置在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)[35,36]。

1.4 拮抗細(xì)菌的篩選

圖1 離體拮抗試驗示意圖 Fig.1 The schematic of in vitro antagonism test

使用平板對峙法[37]在直徑90mm的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板中央接種直徑5mm的小麥赤霉病菌菌餅，按圖1所示在小麥赤霉病菌菌餅周圍接上純化后的內(nèi)生菌，以空白培養(yǎng)基作為空白對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，放入28℃等溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4d，待空白對照長滿整個培養(yǎng)皿時，根據(jù)抑菌圈直徑計算拮抗效果[35,36]。

1.5 拮抗菌株XG-6培養(yǎng)條件的研究

選用平板對峙法[37]測定拮抗菌株XG-6對4種病原真菌(白絹病菌、棉花立枯病菌、火龍果炭疽病菌、梨黑斑病菌)的拮抗作用。利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖作為碳源(碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)液：(NH4)2SO42.0g，NaH2PO4·H2O 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.1g，蒸餾水1000mL，pH=7.0)，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨作為氮源(氮源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO41.36g，NaHPO42.13g，MgSO4·7H2O 0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5mg，CaCl25mg，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL，pH=7.0)，檢測菌株XG-6的碳源與氮源的利用情況，待其在培養(yǎng)基上生長3d后測定其溫度及pH生長曲線、耐藥性以及明膠液化、淀粉水解、酪蛋白水解等特征[38]。

1.6 拮抗菌株XG-6的鑒定

使用改良的CTab法[39]提取菌株XG-6的基因組DNA，并用16S rDNA的通用引物(正向引物：27F；反向引物：1492R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞公司測序，測序結(jié)果通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST比對，明確菌種種類。

1.7 培養(yǎng)箱條件下XG-6對赤霉病防治效果的測定

選取尺寸相同且顆粒飽滿的小麥種子進(jìn)行消毒：①70%乙醇漂洗10s；②2%次氯酸鈉浸泡25min；③ddH2O清洗3～5遍。拮抗菌XG-6在PDA平板上培養(yǎng)至菌絲鋪滿整個培養(yǎng)基，然后用ddH2O洗下制成菌懸液。赤霉菌用綠豆培養(yǎng)基搖菌7～10d。

消毒后的種子分成3份后作為3個處理組進(jìn)行試驗：①對照：使用ddH2O浸種12h，并且不接種赤霉菌；②生理鹽水+赤霉菌：使用ddH2O浸種12h，然后接種赤霉菌；③赤霉菌+拮抗菌：使用XG-6的菌懸液浸種12h，然后接種赤霉菌。催芽后在20℃、16h/8h(白天/夜晚)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在播種第15天和第25天時統(tǒng)計發(fā)病苗數(shù)，并計算發(fā)病率(發(fā)病率=發(fā)病苗數(shù)/總苗數(shù)×100%)，同時稱量第25天時每盆麥苗的鮮重和干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗內(nèi)生菌的篩選

根據(jù)菌落形態(tài)的差異性，經(jīng)過平板對峙法測定，從中篩選出7株對小麥赤霉病菌有拮抗作用的內(nèi)生菌，經(jīng)差異顯著性比較，結(jié)果顯示有差異(P<0.01)(見表1)。其中，菌株XG-6的抑菌圈的直徑達(dá)31.19mm，因此選取XG-6菌株用于進(jìn)一步研究。其對小麥赤霉病菌的拮抗效果如圖2所示。

表1 分離到的拮抗菌抑菌圈直徑及其來源

圖2 拮抗菌株XG-6對小麥赤霉病菌的拮抗效果 Fig.2 Antagonistic effect of antagonistic strain XG-6 on wheat Fusarium graminearum

2.2 XG-6菌株的拮抗譜

XG-6菌株對4種供試病原菌的生長均有抑制效果(見表2)，為廣譜性拮抗菌，其中對火龍果炭疽病菌的抑菌圈直徑為35.93mm，抑制效果最好。

表2 拮抗菌株XG-6對4種病原菌的拮抗效果

2.3 XG-6拮抗菌株的培養(yǎng)條件

XG-6的生長曲線圖、最適溫度生長曲線圖和最適pH生長曲線圖如圖3所示。結(jié)果表明，XG-6菌株在接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液后的24h內(nèi)為對數(shù)生長期,24～72h內(nèi)為穩(wěn)定期,72h后進(jìn)入衰退期；XG-6菌株能在10～50℃環(huán)境下生長，適宜生長的溫度為25～30℃；XG-6菌株pH在3～10范圍內(nèi)均能生長，其中適宜生長的pH范圍為6～9，pH為3時基本不生長。

圖3 XG-6的生長曲線圖、最適溫度生長曲線圖和最適pH生長曲線圖Fig.3 Growth curve, optimal temperature growth curve and optimal pH growth curve of XG-6

XG-6菌株的生理生化特征如表3所示。XG-6菌株可將蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖作為碳源，將蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨作為氮源，且XG-6的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，其淀粉水解及明膠水解都呈陽性但酪素水解呈陰性。

表3 XG-6菌株的生理生化特征

2.4 XG-6拮抗菌株耐藥性測定

拮抗菌XG-6耐藥性測定結(jié)果如表4所示，拮抗菌XG-6在加入不同抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d后的生長情況如圖4所示。試驗結(jié)果表明，XG-6拮抗菌株對于氯霉素、氨芐西林鈉2種抗生素表現(xiàn)極強(qiáng)的耐藥性，對四環(huán)素也具有一定的耐藥性，而對鏈霉素和卡那霉素的耐藥性相對較弱。

表4 拮抗菌XG-6耐藥性測定結(jié)果

圖4 拮抗菌XG-6在加入不同抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d后的生長情況Fig.4 Growth of antagonistic becteria XG-6 cultured in medium with different antibiotics for 2d

2.5 拮抗菌XG-6鑒定結(jié)果

測序結(jié)果表明，XG-6菌株的16S rDNA序列含有1509個堿基。將該序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示XG-6菌株初步被判斷為芽胞桿菌(Bacillus)。根據(jù)BLAST的結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖5)。結(jié)果顯示XG-6與解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)具有93%的相似性，可以將研究所分離的菌株XG-6認(rèn)定為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖5 XG-6菌株的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of the 16S rDNA sequence of strain XG-6

2.6 培養(yǎng)箱條件下XG-6對赤霉病的防治效果

將實驗室篩選出的拮抗菌株XG-6施用于麥苗上，觀察其抗赤霉病的效果。蒸餾水+赤霉菌的處理在第15天和第25天時的發(fā)病率分別為56.33%和82.67%，使用XG-6+赤霉菌處理的小麥在第15天和第25天時的發(fā)病率分別為36.00%和51.67%(見圖6(a))，拮抗菌株XG-6降低了赤霉病的發(fā)病率。與蒸餾水+赤霉菌處理相比，XG-6+赤霉菌處理的鮮重質(zhì)量較高，干重質(zhì)量變化較小(見圖6(b))。

圖6 培養(yǎng)箱條件下XG-6對赤霉病的防治效果Fig.6 Control effect of XG-6 on Fusarium head blight under incubator condition

3 討論與結(jié)論

解淀粉芽胞桿菌于1943年首次在日本土壤中被發(fā)現(xiàn)[40]，該菌隸屬芽胞桿菌屬[41]，是一種嗜溫好氧細(xì)菌，在自然界中廣泛存在。因其繁殖速度快、生命力較強(qiáng)、安全性高對人畜無害并具有非常強(qiáng)的抗逆性等特點[42]，非常適于作為生物防治菌種，深受廣大科研人員的重視。研究表明解淀粉芽胞桿菌會產(chǎn)生抗菌蛋白或胞外水解酶等物質(zhì)直接抑制和破壞病原菌[43,44]。一些學(xué)者認(rèn)為，解淀粉芽胞桿菌會誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生抗病性，進(jìn)而抵抗其他病害的入侵，還有可能是因為解淀粉芽胞桿菌本身體積較大，會與病原菌競爭相應(yīng)的生存空間并且其繁殖速度較快會快速搶占植物的營養(yǎng)物質(zhì)，使病原菌無法生長。

目前有關(guān)解淀粉芽胞桿菌用于防治植物病害的研究很多，并且市場上已有了一些拮抗菌制成的商品[45]。馮志敏等[46]分離出枯草芽胞桿菌和蠟狀芽孢桿菌菌株對葡萄灰霉病具有抗性。劉仕飛等[47]分離出拮抗小麥紋枯病的細(xì)菌菌株XZ18-3。郝建安等[43]得到的NK10.BAhjaWT菌株對水稻紋枯病菌、黑曲霉、黑痘病菌等多種病原菌的拮抗作用均較好。孟利強(qiáng)等[48]也從大豆中分離到了菌株TF28。由此可見，解淀粉芽胞桿菌對病原菌的拮抗作用具有非常好的應(yīng)用前景。

該研究從湖北省荊州市小麥赤霉病發(fā)病地區(qū)采集1株健康小麥植株，分離得到了拮抗菌株XG-6，通過16S rDNA序列鑒定為解淀粉芽胞桿菌。結(jié)果表明，該菌株對小麥赤霉病菌具有效果顯著的拮抗作用的同時，對所測試的4種病原菌(火龍果炭疽病菌、棉花立枯病菌、白絹病菌、梨黑斑病菌)都有良好的拮抗作用，具有廣譜性，且對于3種抗生素氯霉素、鏈霉素、氨芐西林鈉有極強(qiáng)的耐藥性。蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖可作為XG-6菌株的碳源，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨可作為氮源，培養(yǎng)條件要求相對不高，易于培養(yǎng)。在培養(yǎng)箱的條件下XG-6菌株抗赤霉菌的效果明顯。

該研究均在實驗室條件下完成，在實際生產(chǎn)中，XG-6產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)能否在自然條件下發(fā)揮良好的拮抗作用，以及拮抗菌株XG-6產(chǎn)生何種拮抗物質(zhì)、拮抗物質(zhì)的理化性質(zhì)等尚不清楚，這些問題都有待進(jìn)一步研究。