枯草芽孢桿菌YZU-S149的分離鑒定及對(duì)西瓜枯萎病的生防作用

孫正祥，龍欣鈺，孟祥佳，曹帥，毛國(guó)慶，周燚

1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025 2.湖北省農(nóng)林病蟲(chóng)害預(yù)警與調(diào)控工程技術(shù)研究中心(長(zhǎng)江大學(xué))，湖北 荊州 434025

由尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型(Fusariumoxysporumf. sp.niveum, FON)(病原真菌西瓜枯萎病菌)引起的西瓜枯萎病是一種土傳病害，是西瓜生產(chǎn)中發(fā)生最廣泛、危害最嚴(yán)重的病害之一，發(fā)病率較高，甚至可導(dǎo)致絕收[1]。西瓜枯萎病菌的厚垣孢子可以在土壤中生存長(zhǎng)達(dá)10年，并且能夠在多種作物上生存，這給疾病控制帶來(lái)了困難[2,3]。目前尚無(wú)理想的防治方法，嫁接防治會(huì)影響西瓜的口感及品質(zhì)，抗病品種培育周期長(zhǎng)，且易喪失抗病性；化學(xué)農(nóng)藥高劇毒高殘留，對(duì)人畜有毒害作用[4,5]。而生物防治相對(duì)安全有效，符合可持續(xù)性農(nóng)業(yè)發(fā)展要求，因此利用微生物制劑防治西瓜枯萎病具有重要的實(shí)踐意義。近年來(lái)，利用生防菌株防治西瓜枯萎病已有不少相關(guān)報(bào)道，如非致病鐮刀菌(Fusariumspp.)[6]、芽孢桿菌(Bacillusspp.)[7]、綠色木霉(Trichodermviride)[8]和綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)[9]等。然而上述生防菌株大多數(shù)存在田間效果不穩(wěn)定、貨架期短等問(wèn)題[10]。對(duì)節(jié)白蠟(Fraxinushupehensis)首先發(fā)現(xiàn)于湖北，為中國(guó)特有種，具有重要的藥用價(jià)值，鮮有病蟲(chóng)害發(fā)生[11]，推測(cè)其體內(nèi)含有能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的微生物，幫助其免于病蟲(chóng)害為害。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)對(duì)節(jié)白蠟的研究主要集中在園林園藝[12]、人工栽培[13]、化學(xué)成分[14]等方面，但對(duì)于對(duì)節(jié)白蠟內(nèi)生菌的研究鮮有報(bào)道。為此，該研究從對(duì)節(jié)白蠟根部和根際土壤中分離篩選對(duì)西瓜枯萎病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的細(xì)菌，測(cè)定其抑菌譜、生防特性及盆栽防效，以期為西瓜枯萎病生防制劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病原真菌西瓜枯萎病菌、馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、小麥赤霉病菌(F.graminearum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)和玉米莖基腐病菌(F.moniliforme)均由本課題組分離與保存。

西瓜品種為西農(nóng)八號(hào)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)選育。培育西瓜所用的基質(zhì)土為長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院自行研發(fā)的育苗專(zhuān)用土。

培養(yǎng)基包括營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)及其固體培養(yǎng)基(NA)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)及其固體培養(yǎng)基(PDA)、幾丁質(zhì)酶檢測(cè)培養(yǎng)基[15]、蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基[16]、纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基[17]、嗜鐵素檢測(cè)培養(yǎng)基[18]。

1.2 西瓜枯萎病生防菌株的篩選及其生防特性的測(cè)定

1.2.1 生防菌株的分離與純化

稱(chēng)取1g對(duì)節(jié)白蠟幼根組織，采用75%的酒精浸泡1min，4%的NaClO浸泡 5min，將消毒后的根部組織用無(wú)菌水沖洗3次后于無(wú)菌研缽中充分研磨，取所得研磨液依次稀釋至10-4、10-5和10-6，每個(gè)濃度取100μL涂布于NA平板。另取對(duì)節(jié)白蠟根際土約10g，倒入100mL三角瓶中并加入90mL無(wú)菌水，于130r/min、28℃條件下培養(yǎng)30min制成母液。將母液依次稀釋至10-6、10-7和10-8，分別取100μL稀釋液涂布于NA平板。將上述平板置于培養(yǎng)箱中，28℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)濃度重復(fù)3次。2～3d后挑取形態(tài)、顏色和大小等不同的單菌落，轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌株的篩選及抑菌譜的測(cè)定

1)初篩。將PDA平板上培養(yǎng)5d的西瓜枯萎病菌菌餅(6mm)置于PDA平板中央，在距離菌餅中心2.5cm對(duì)稱(chēng)劃線接種待測(cè)菌株，28℃恒溫培養(yǎng)，4d后測(cè)量抑菌帶的大小。

2)復(fù)篩。采用平板對(duì)峙法，挑取培養(yǎng)了5d的西瓜枯萎病菌菌餅接種至PDA平板中央，在與平板中央等距離的3點(diǎn)處用無(wú)菌打孔器對(duì)稱(chēng)打孔，向孔中注入振蕩培養(yǎng)2d的待測(cè)菌液，每孔50μL，28℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照西瓜枯萎病菌長(zhǎng)至2/3時(shí)，測(cè)量菌落半徑并計(jì)算抑制率[19]。抑菌譜測(cè)定：選擇抑菌活性較強(qiáng)的菌株，采用與初篩相同的方法測(cè)定其對(duì)馬鈴薯晚疫病菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌和玉米莖基腐病菌的抑菌活性。

1.2.3 拮抗菌株的生防特性

1)幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)。取培養(yǎng)2d后的拮抗菌發(fā)酵液10μL，接種至幾丁質(zhì)酶檢測(cè)平板上，28℃培養(yǎng)3d后觀察拮抗菌菌落周?chē)袩o(wú)透明圈。

2)蛋白酶活性檢測(cè)。用牙簽挑取培養(yǎng)好的拮抗菌接種至蛋白酶檢測(cè)平板中央，28℃培養(yǎng)3d后，觀察菌落周?chē)袩o(wú)透明圈。

3)纖維素酶活性檢測(cè)。將拮抗菌株接種到纖維素酶活性檢測(cè)平板上，28℃恒溫培養(yǎng)3d，向培養(yǎng)皿中加入1mg/mL的剛果紅溶液至平板表面完全被浸沒(méi)，靜置30min，棄染液，用1mol/L的NaCl溶液洗滌，觀察菌落周?chē)袩o(wú)透明圈。

4)嗜鐵素檢測(cè)。將待測(cè)菌株接種到嗜鐵素檢測(cè)培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d，觀察是否出現(xiàn)黃色暈圈。

1.3 盆栽防效測(cè)定

選擇健康飽滿的西瓜種子催芽后挑選出芽一致的西瓜種子分別播種至裝有無(wú)菌基質(zhì)土的育苗盆中，于溫室中((28±2)℃，光照時(shí)間∶黑暗時(shí)間=16h∶8h)培養(yǎng)。待西瓜苗長(zhǎng)出3片真葉時(shí)，將其移栽至裝有病土的盆缽中。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理：①YZU-S7+FON；②YZU-S146+FON；③YZU-S149+FON；④百菌清500倍稀釋液+FON；⑤NB+FON。

西瓜枯萎病菌分生孢子懸浮液的制備：挑取西瓜枯萎病菌的菌餅接種至PDB培養(yǎng)基中，28℃、130r/min培養(yǎng)5d，采用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定其孢子濃度。接種時(shí)將分生孢子懸浮液與無(wú)菌基質(zhì)土混合均勻制成病土(1×105cfu/g)。

細(xì)菌懸浮液的制備：活化菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146后，將其分別接種至NB培養(yǎng)基中，28℃、130r/min培養(yǎng)48h，制成濃度為1×108cfu/mL的菌懸液。

移栽西瓜苗后采用灌根法接種細(xì)菌懸浮液，每株5mL。每隔5d進(jìn)行1次試驗(yàn)處理，共處理3次。以接種等體積NB培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理10株西瓜苗，3次重復(fù)。在最后一次接菌后第18天調(diào)查各處理西瓜苗的發(fā)病情況，計(jì)算其病情指數(shù)和防效[20]。

1.4 拮抗菌株的形態(tài)學(xué)及分子鑒定

將篩選出來(lái)的具有拮抗作用的菌株接種到NA培養(yǎng)基上，觀察并記錄其菌落的形態(tài)、邊緣、顏色、大小及光澤等。使用OMEGA細(xì)菌基因組提取試劑盒提取YZU-S149 DNA，并采用16S rDNA通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R: (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(40μL)：PCR StarMix 20μL、正引物1.0μL、反引物1.0μL、DNA模板 2.0μL和ddH2O 16μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s、58℃退火40s、72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min。取少量PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析，采用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離和初篩

從對(duì)節(jié)白蠟幼根及根際中共分離出細(xì)菌303株，對(duì)西瓜枯萎病菌表現(xiàn)出拮抗作用的菌株共有50株，其中拮抗帶寬大于5mm的有14株，大多為內(nèi)生菌(見(jiàn)表1)。

表1 西瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的分離與初篩

2.2 拮抗菌株的復(fù)篩

西瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的復(fù)篩結(jié)果表明，菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146對(duì)西瓜枯萎病菌的拮抗效果較好，抑菌率分別為68.90%、73.51%和75.34%(見(jiàn)表2和圖1)。

表2 西瓜枯萎病拮抗菌株的復(fù)篩

圖1 拮抗細(xì)菌對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of antagonistic bacteria on watermelon Fusarium wilt

2.3 拮抗菌株的抑菌譜及生防特性測(cè)定

抑菌譜測(cè)定結(jié)果表明，菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146對(duì)水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、玉米莖基腐病菌和馬鈴薯晚疫病菌均有較強(qiáng)的拮抗作用(見(jiàn)表3和圖2)。生防特性的測(cè)定結(jié)果顯示，這3株菌株均能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素，但不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。

表3 拮抗菌株的抑菌譜測(cè)定

2.4 拮抗菌株對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，在最后一次接菌后18d后，菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146對(duì)西瓜枯萎病的防效分別為51.76%、75.87%和65.48%，其中菌株YZU-S149的防效最好，且菌株YZU-S149和YZU-S146的防效均高于對(duì)照藥劑百菌清(見(jiàn)表4)。

表4 3株拮抗菌株對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效(接菌后18d)

2.5 生防菌株的鑒定

菌株YZU-S149的菌落扁平，正面呈灰白色，反面呈黃色，表面無(wú)光澤，略微干燥，邊緣不規(guī)則，菌落正中間較平坦，四周有明顯的皺褶隆起。16S rDNA序列分析表明，菌株YZU-S149的序列與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)IAM12118的序列相似度為100%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，菌株YZU-S149與枯草芽孢桿菌處在同一分支上(見(jiàn)圖3)，初步鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。

注：A為水稻紋枯病菌；B為小麥赤霉病菌；C為玉米莖基腐病菌; D為馬鈴薯晚疫病菌。圖2 菌株對(duì)4種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Fig. 2 The inhibition effect of strains on mycelial growth of four pathogenic fungi

圖3 基于YZU-S149的16S rDNA序列及其相似序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of YZU-S149 and its homologous sequences

3 結(jié)論與討論

西瓜枯萎病是西瓜生產(chǎn)中最嚴(yán)重、影響最廣泛的病害之一，是制約西瓜生產(chǎn)的的一種世界性土傳真菌病害[21]。因此，對(duì)西瓜枯萎病的防治十分重要，生產(chǎn)上亟需解決的問(wèn)題就是探索安全有效的防治方法。生物防治是利用微生物及其代謝產(chǎn)物防治植物病害，在保證經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，環(huán)境污染也較小，具有很好的應(yīng)用前景[22]。為了獲得對(duì)西瓜枯萎病菌具有良好抑制作用的的生防細(xì)菌，本研究從對(duì)節(jié)白蠟的根部及根際篩選出3株對(duì)西瓜枯萎病菌具有顯著抑制活性的內(nèi)生菌株，具有廣譜抑菌作用，表明其能產(chǎn)生抑菌活性較強(qiáng)的活性代謝產(chǎn)物，然而其產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)成分尚不明確，還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

該研究篩選的3株細(xì)菌均能產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶和嗜鐵素，生防菌株可通過(guò)產(chǎn)生胞外酶降解病原菌的細(xì)胞壁，從而發(fā)揮生防作用[23]。鐵元素是大多數(shù)微生物生存所必需的成分，因此，生防菌通過(guò)產(chǎn)生嗜鐵素，大量吸收環(huán)境中的鐵離子，最終導(dǎo)致病原菌因缺鐵而失去致病能力[24]。芽孢桿菌是一類(lèi)重要的生防菌株，已得到廣泛開(kāi)發(fā)和應(yīng)用[25]。該研究選擇對(duì)西瓜枯萎病盆栽防效最好的菌株YZU-S149進(jìn)行鑒定，通過(guò)形態(tài)特征以及16S rDNA序列分析將其鑒定為枯草芽孢桿菌。目前用于西瓜枯萎病的生防細(xì)菌主要是芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)[26]。李丹等[10]篩選的2株解淀粉芽胞桿菌不僅對(duì)西瓜枯萎病菌具有良好的抑菌活性，還能夠分解土壤中不能直接被植物吸收的物質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化為植物可吸收的營(yíng)養(yǎng)，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。馬利平等[27]分離的芽孢桿菌B96-Ⅱ不僅對(duì)西瓜枯萎病有較好的防效，對(duì)其他枯萎病有良好的防效。孫正祥等[28]分離的枯草芽孢桿菌XG-1具有促生作用，且有效定殖于西瓜根際與植株體內(nèi)。該研究的菌株YZU-S149對(duì)西瓜枯萎病的室內(nèi)盆栽防效為75.87%，優(yōu)于百菌清500倍稀釋液的施用效果，具有良好的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用前景。

該研究從對(duì)節(jié)白蠟中分離和篩選了西瓜枯萎病的生防菌株，并測(cè)定了拮抗菌株的盆栽防效，下一步將繼續(xù)測(cè)定其田間防效，以期為西瓜枯萎病的微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，實(shí)現(xiàn)藥肥雙減目標(biāo)。