富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征及其功能特性

劉思杉，冮 潔,*，朱淑珍，陳濤濤，鄧海平，劉 堯，曲鵬坤，袁家誠，潘 琴

（1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600；2.銅仁科學(xué)院梵凈山生物資源研究所，貴州 銅仁 554300）

秀珍菇（Pleurotus geesteranus）屬于擔(dān)子菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬，是一種味道鮮美的食用真菌[1]。秀珍菇營養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質(zhì)、粗脂肪、多糖和多種維生素[2]。研究表明，秀珍菇多糖具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抑菌[5]、降血脂[6]等多方面的生物功能。鋅是人體必需微量元素之一，不但參與40多種酶的組成，更是穩(wěn)定人體所必需的物質(zhì)（RNA、DNA、核糖體）[7]。鋅有“兒童生長素”之稱，缺鋅可致免疫力低下、佝僂病及貧血，營養(yǎng)不良及反復(fù)呼吸道感染，不同程度影響兒童生長發(fā)育[8-9]，甚至導(dǎo)致出現(xiàn)異食癖[10]。硒是機(jī)體生命活動必需的一種微量元素，能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，抵抗有關(guān)疾病的發(fā)生。硒不能由機(jī)體自主合成，只能從體外攝取[11]。食用菌對微量元素有很好的富集作用，食用菌能將鋅、硒轉(zhuǎn)化為易被人體吸收的有機(jī)鋅、有機(jī)硒，由于沒有毒副作用，食用菌富鋅、富硒食品越來越受到人們的重視，富鋅、富硒食用菌也成為研究熱點。

近年來國內(nèi)外對食用菌蛋白質(zhì)的研究越來越多，薛媛等[12]研究白靈菇蛋白質(zhì)的理化和功能性質(zhì)發(fā)現(xiàn)60%鹽飽和度析出的蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的溶解性、起泡性、易消化水解；史瑞婕等[13]研究不同離子強(qiáng)度、溫度、pH值和蔗糖濃度對杏鮑菇蛋白質(zhì)功能特性的影響；Kimatu等[14]對雙孢蘑菇分離蛋白水解超濾后研究發(fā)現(xiàn)其多肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性；蘇德偉等[15]對菌草竹蓀子實體蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值進(jìn)行了評價，證明其具有較高的營養(yǎng)價值。但是目前對富硒秀珍菇栽培[16-18]的研究較多，對富鋅秀珍菇及富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的研究較少，特別是對富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)功能特性鮮見報道。本實驗以富鋅、富硒秀珍菇為材料，研究富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征及其功能特性，旨在為富硒、富鋅食用菌蛋白質(zhì)資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秀珍菇（P.geesteranus）品種為基因2005，在貴州銅仁萬山區(qū)種植，富鋅秀珍菇是在秀珍菇普通栽培基料中加入硫酸鋅，添加量分別為200、350、500 mg/kg栽培獲得，Zn200、Zn350、Zn500秀珍菇中總鋅含量分別為58.94、65.38、53.90 mg/kg；富硒秀珍菇是在基料中加入亞硒酸鈉，添加量分別為20、60、100 mg/kg栽培獲得，Se20、Se60、Se100秀珍菇總硒含量分別為103.78、140.36、139.80 mg/kg；CK為空白對照，為未加鋅或硒栽培獲得的秀珍菇，其中鋅含量為45.77 mg/kg，硒含量為2.16 mg/kg。

溴化鉀（光譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；試劑未說明則均為分析純或化學(xué)純；胃蛋白酶（來自豬胃黏膜）（效價15 000 NFU/mg）、胰蛋白酶（來自牛胰）（效價250 NFU/mg） 上海傅葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；H-2050R臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-2800/2802/2802S紫外分光光度計龍尼柯（上海）儀器有限公司；BCD-321WDJ冰箱青島海爾股份有限公司；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京市六一儀器廠；SX-610型筆式pH計 上海三信儀表廠；HC-2062高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SCIENTZ-5T超聲波提取機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；FOSS KjeltecTM2300全自動凱氏定氮儀福斯分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

秀珍菇子實體干燥后粉碎過0.2 mm篩網(wǎng)，獲得秀珍菇菌粉待用。

1.3.2 蛋白質(zhì)的提取

參照張璐[19]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱取10.0 g（精確到0.000 1 g）秀珍菇樣品，浸泡至完全復(fù)水，料水比為1∶30（g/mL），50 ℃超聲30 min，1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 10.0，離心，取上清液。滴加1 mol/L HCl溶液調(diào)pH 5.0，靜置，進(jìn)行離心，離心后取沉淀水洗至中性，進(jìn)行冷凍干燥，干燥后即為粗蛋白質(zhì)，并稱質(zhì)量。

蛋白質(zhì)含量：采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法測定；蛋白質(zhì)中鋅、硒含量：采用GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》中電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定。

1.3.3 蛋白質(zhì)組分分析

參照文獻(xiàn)[20]方法提取蛋白組分并測定蛋白含量。取1.0 g秀珍菇菌粉樣品于離心管中，加入10 mL去離子水，25 ℃超聲60 min進(jìn)行提取，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清液，沉淀中再加入10 mL去離子水超聲提取30 min，同樣條件離心后取上清液，合并2 次上清液獲得組分I；然后依次使用0.5 mol/L NaCl溶液提取獲得組分II、55%異丙醇溶液提取獲得組分III、55%異丙醇-0.6%巰基乙醇溶液提取獲得組分IV、0.6%巰基乙醇和0.5 mol/L NaCl配制的硼酸緩沖液提取獲得組分V、0.6%巰基乙醇和0.5%烷基硫酸鈉配制的硼酸緩沖液提取獲得組分VI，重復(fù)上述步驟提取并測定蛋白含量。

1.3.4 表面疏水性的測定

取適量秀珍菇蛋白質(zhì)粉溶于pH 7.0的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液中，使蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL。取1 mL上述蛋白溶液，加入200 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，以磷酸鹽緩沖液作對照，6 000×g離心15 min，取上清液稀釋10 倍，測定其在595 nm波長處吸光度。表面疏水性以溴酚藍(lán)結(jié)合量表示，計算如式（1）所示：

式中：A對照為磷酸鹽緩沖液的吸光度；A樣品為上清液的吸光度。

1.3.5 游離巰基含量與二硫鍵含量的測定

使用Ellman’s試劑比色法[21]測定秀珍菇蛋白質(zhì)游離巰基與二硫鍵含量。稱取75.0 mg秀珍菇菌粉樣品于1 mL Tris-甘氨酸緩沖液中混勻后加4.7 g鹽酸胍，用緩沖液定容至10 mL。取1 mL溶液與4 mL脲-鹽酸胍溶液和0.05 mL Ellman’s試劑混勻，412 nm波長處測吸光度。取1 mL溶液與0.05 mL巰基乙醇和4 mL脲-鹽酸胍溶液，于25 ℃保溫1 h后，加入10 mL 12%三氯乙酸溶液，繼續(xù)于25 ℃保溫1 h，5 000 r/min離心10 min，用5 mL 12%三氯乙酸溶液清洗沉淀物2 次，將沉淀物溶于10 mL 8 mol/L脲中，加0.04 mL Ellman’s試劑，412 nm波長處測吸光度。實驗以不加樣品，加Ellman’s試劑作為試劑空白。巰基含量和二硫鍵含量按式（2）、（3）計算：

式中：A412nm為溶液在412 nm波長處的吸光度；D為稀釋因子；C為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

式中：N1為還原前的巰基數(shù)；N2為還原后的巰基數(shù)。

1.3.6 二級結(jié)構(gòu)的測定

采用傅里葉紅外光譜法[22]測定秀珍菇蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。取少量溴化鉀于瑪瑙研缽中，在紅外燈下研磨2 min，然后加入少量蛋白粉與溴化鉀混合繼續(xù)研磨粉碎均勻，將研磨好的樣放入壓膜中，用壓片機(jī)壓片2 min后取出，得到半透明的薄片。用傅里葉變換紅外光譜儀對制好的透明薄片進(jìn)行光譜掃描。用Peakfit軟件截取不同蛋白在酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）處的紅外光譜圖譜，校正基線，作二階求導(dǎo)后得到分布曲線，分別計算各子峰面積占總面積的百分比，對應(yīng)蛋白質(zhì)不同的二級結(jié)構(gòu)百分含量。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

配制分離膠15%，濃縮膠5%，其他參照李春紅[23]的方法。

1.3.8 體外消化率的測定

參照文獻(xiàn)[24]進(jìn)行測定。稱取適量蛋白粉溶于1%NaCl溶液中，用1 mol/L HCl溶液將溶液pH值調(diào)至1.5，使最終蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL。先將新鮮配制的胃蛋白酶溶液在37.5 ℃水浴中預(yù)熱10 min，然后將預(yù)熱好的胃蛋白酶溶液加入蛋白溶液，在37.5 ℃振蕩水浴中繼續(xù)消化2 h。將反應(yīng)后的消化液pH值調(diào)至7.5，加入新鮮配制的胰蛋白酶溶液，37.5 ℃消化2 h。消化完畢煮沸10 min使酶失活，加入等體積10% TCA沉淀蛋白，取濾液凱氏定氮，測定胃-胰蛋白酶消化率。

1.3.9 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的功能特性

1.3.9.1 持水性測定

采用Rashmi等[25]的方法，并適當(dāng)改動。準(zhǔn)確稱取0.4 g蛋白質(zhì)于離心管中，緩慢加入蒸餾水20 mL，振蕩，使樣品與水混勻。將混合物在一定溫度下靜置20 min，于4 500 r/min離心15 min，傾出離心管多余水分，稱取沉淀和瓶的總質(zhì)量，按式（4）計算持水性：

式中：m0為蛋白質(zhì)的質(zhì)量；m1為離心管的質(zhì)量；m2為沉淀和離心管的總質(zhì)量。

1.3.9.2 持油性測定

實驗方法及計算公式參照1.3.9.1節(jié)。準(zhǔn)確稱取0.4 g蛋白質(zhì)粉于離心管中，緩慢加入食用油10 mL，振蕩，使樣品與水混勻。將混合物在一定溫度下靜置20 min，于4 500 r/min離心15 min，傾出離心管多余食用油，稱取沉淀和瓶的總質(zhì)量，按式（5）計算持油性：

式中：m0為蛋白質(zhì)的質(zhì)量；m1為離心管的質(zhì)量；m2為沉淀和離心管的總質(zhì)量。

1.3.9.3 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定

用pH 7.0的0.2 mol/L磷酸緩沖液配制質(zhì)量濃度為2 g/L的蛋白溶液100 mL，在高壓均質(zhì)機(jī)中，均質(zhì)2 min，測量泡沫的總體積；分別靜置30、60、90 min后泡沫的總體積。按式（6）、（7）計算起泡性及泡沫穩(wěn)定性：

1.3.9.4 乳化性測定

參照管軍軍等[26]方法。取9 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的蛋白溶液（樣品蛋白溶于0.2 mol/L、pH 7.0磷酸緩沖液中），加入3 mL大豆色拉油，在10 000 r/min均質(zhì)1 min，迅速從底部取樣，用0.1%的SDS將其稀釋50 倍，在500 nm波長處測定吸光度，記為0時刻的吸光度，均質(zhì)5 min后重復(fù)上述操作，測定5 min時的吸光度A0。以SDS溶液為空白。以乳化活力指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）表示乳化性，EAI按式（8）計算：

式中：EAI為1 g蛋白質(zhì)的乳化區(qū)域/（m2/g）；N為稀釋倍數(shù)；θ為油相所占比例；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；L為比色皿中光路長度（1 cm）。

乳化穩(wěn)定指數(shù)（emulsification stability index，ESI）表示乳化穩(wěn)定性，ESI按式（9）計算：

式中：ΔT為時間差（5 min）；ΔAT為ΔT內(nèi)的吸光度差。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)及其鋅、硒含量分析

由表1可知，7 個秀珍菇樣品中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在19.87%～25.41%之間，富鋅秀珍菇的蛋白含量隨著鋅含量的增加而減小，但均高于CK；而富硒秀珍菇的蛋白質(zhì)含量隨著硒含量的增加，先增加后減少。富鋅秀珍菇Zn200中總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為25.41%，比CK提高18.35%；富硒秀珍菇Se60粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為62.92%，提高了7.63%。該結(jié)果說明適宜的鋅、硒含量能提高秀珍菇內(nèi)蛋白質(zhì)的含量。選擇適宜濃度下栽培獲得的富鋅秀珍菇和富硒秀珍菇，對其蛋白質(zhì)中的鋅含量和硒含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明在Zn350秀珍菇中鋅含量為65.38 mg/kg，其中蛋白鋅含量為21.70 mg/kg，占總鋅的33.19%；Se20秀珍菇中硒含量為103.78 mg/kg，其中蛋白硒含量為23.87 mg/kg，占總硒的23.00%。由于各樣品蛋白質(zhì)結(jié)合的鋅、硒含量不同，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變，溶解度改變，同一條件下提取出的蛋白量存在差異，導(dǎo)致蛋白提取率出現(xiàn)了升高或降低的情況，秀珍菇Se20的蛋白提取率最大，達(dá)到29.05%。

表1 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)含量Table 1Extraction rates of proteins from zinc-enriched and selenium-enriched P.geesteranus %

2.2 富鋅、富硒秀珍菇中的蛋白質(zhì)組分分析

富鋅、富硒秀珍菇樣品的總蛋白質(zhì)含量以及蛋白質(zhì)組分在總蛋白含量中所占百分比如表2所示。利用連續(xù)累進(jìn)法提取的蛋白質(zhì)共6 個組分，其中蛋白質(zhì)組分I是白蛋白；組分II是球蛋白；組分III是醇溶蛋白；組分IV是類醇溶蛋白物質(zhì)；組分V是類谷蛋白物質(zhì)；組分VI是谷蛋白。由蛋白質(zhì)組分結(jié)果可知，在所有秀珍菇樣品中，組分I白蛋白含量最高，其次是組分II球蛋白，而組分IV類醇溶蛋白物質(zhì)含量最低。由表2可見，富鋅、富硒后秀珍菇的白蛋白和球蛋白含量與CK比具有顯著差異，其中富鋅、富硒秀珍菇白蛋白含量降低，球蛋白含量升高，但白蛋白仍為含量最高的蛋白組分。增加秀珍菇蛋白質(zhì)中白蛋白、球蛋白的含量，其營養(yǎng)價值也會隨之升高。

表2 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的組分分析Table 2Compositional analysis of proteins sequentially extracted from zinc-enriched and selenium-enriched P.geesteranus

2.3 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的表面疏水性分析

蛋白結(jié)合溴酚藍(lán)的量越大，表面疏水性也越高。蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露程度越多，蛋白的表面疏水性越大[27]。由圖1可以看出，富鋅、富硒秀珍菇蛋白的溴酚藍(lán)結(jié)合量均高于CK，說明富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的表面疏水基團(tuán)暴露高于CK，因此表面疏水性優(yōu)于CK。另外，富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的表面疏水性隨著鋅、硒含量的增加逐漸增大。分析其原因可能是鋅、硒的結(jié)合使蛋白質(zhì)的內(nèi)部環(huán)境發(fā)生改變，β-折疊和無規(guī)卷曲相對含量較高時，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變的松散[28]，疏水性氨基酸殘基暴露于蛋白質(zhì)分子表面，從而使表面疏水性能升高[29]。表面疏水性大有利于蛋白質(zhì)的乳化作用，但會降低對水的親和力，無益于持水性。

圖1 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的表面疏水性Fig.1 Surface hydrophobicity of proteins from zinc-enriched and selenium-enriched P.geesteranus

2.4 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)游離巰基及二硫鍵含量分析

二硫鍵是蛋白質(zhì)中特別重要的功能基團(tuán)，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起關(guān)鍵的作用。硒、鋅分別通過取代氨基酸中硫原子和與巰基形成配位鍵結(jié)合到蛋白上，導(dǎo)致巰基和二硫鍵的數(shù)量減少，二硫鍵的變化改變了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能特性。蛋白分子之間通過二硫鍵相互交聯(lián)，因而蛋白質(zhì)分子之間的結(jié)合程度可以用巰基和二硫鍵的數(shù)量反映[30]。

如圖2所示，富鋅、富硒秀珍菇中Se60蛋白質(zhì)的巰基含量最高（0.699 μmol/g），Zn350蛋白質(zhì)的二硫鍵含量最高（1.159 μmol/g），但均低于CK。隨著富鋅秀珍菇中鋅含量的增加，巰基含量逐漸減少，而二硫鍵含量先增加后減少；而富硒秀珍菇所測得的巰基含量隨硒含量的增加先上升后下降，二硫鍵隨硒含量的增加先下降后上升。

圖2 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的巰基、二硫鍵含量Fig.2 Sulfhydryl and disulfide bond contents of proteins from zinc-enriched and selenium-enriched P.geesteranus

2.5 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

對秀珍菇樣品的原圖譜曲線進(jìn)行擬合，根據(jù)在酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）處擬合的結(jié)果，可以計算得出蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表3所示。

表3 富鋅、富硒秀珍菇的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析Table 3Secondary structure analysis of proteins from zinc-enriched and selenium-enriched P.geesteranus

由表3可以看出，秀珍菇蛋白質(zhì)存在4 種二級結(jié)構(gòu)，而且不同秀珍菇樣品中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量不同。其中，Zn500的α-螺旋相對含量最高，為18.89%，Zn350的相對含量最低，為11.53%。CK的β-折疊相對含量最高，為39.24%。在這7 個秀珍菇樣品的β-轉(zhuǎn)角中，Se60的相對含量最低，為32.94%，其他樣品都在33.5%以上。Zn350的無規(guī)卷曲相對含量低于其他樣品，為11.91%，其他在13.43%～20.31%之間。Zn200、Zn350秀珍菇蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊與空白組對比明顯降低，β-轉(zhuǎn)角相對含量升高，而Zn500的α-螺旋和β-折疊相對含量降低，分析其原因可能是硫酸鋅添加量過高抑制了Zn500秀珍菇對鋅的吸收，秀珍菇中鋅含量減少，二級結(jié)構(gòu)各含量同另外兩個富鋅樣品比較出現(xiàn)差異。富硒秀珍菇蛋白質(zhì)中的β-折疊相對含量隨著硒含量的增加而增加，但都低于CK；β-轉(zhuǎn)角相對含量隨著鋅含量的增加先增加后減少，隨著硒含量的增加先減少后增加。β-轉(zhuǎn)角和部分α-螺旋向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變，殘基暴露量增大會影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)，導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的一大原因是巰基和二硫鍵含量發(fā)生變化。

2.6 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析

由于秀珍菇蛋白質(zhì)中白蛋白含量最高，且溶于水中。因此，以秀珍菇白蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析其組成，如圖3所示。分析由軟件Quantity one（Bio-Rad）處理后的凝膠圖譜，可知秀珍菇白蛋白樣品的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要分布在32.4～40.3 kDa之間，部分樣品的光密度曲線不同，故而樣品所含有的蛋白條帶數(shù)也不同，蛋白條帶的豐度也有所不同，分子質(zhì)量為32.44 kDa的蛋白條帶在Zn200、Zn350和Zn500中豐度較高，在富硒樣品中豐度相對低，分子質(zhì)量為40.3 kDa的富硒樣品豐度升高。結(jié)合表4分析，Zn500、Zn350、Zn200都含有2 個蛋白條帶，而Se20、Se60、Se100以及CK均含有3 個條帶，并且Zn500、Zn350的蛋白含量顯著提高，其余樣品蛋白含量與CK相比降低，這說明富鋅秀珍菇小分子白蛋白含量增加，總體分子質(zhì)量變小，富硒秀珍菇大分子白蛋白含量增加，總體分子質(zhì)量變大。通過Kjeldahl法測秀珍菇樣品提取到的白蛋白中的蛋白含量，由表4可知，這7 個秀珍菇蛋白質(zhì)量濃度在2.76～3.83 mg/mL之間，明顯可以看出富鋅秀珍菇的蛋白含量較富硒的多，且富硒秀珍菇白蛋白中的蛋白含量均低于CK。

圖3 富鋅、富硒秀珍菇白蛋白的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE patterns of albumin from zinc-enriched and selenium-enriched P.geesteranus

表4 富鋅、富硒秀珍菇白蛋白以及含有蛋白條帶的數(shù)量Table 4Albumin contents and number of protein bands in zincenriched and selenium-enriched P.geesteranus

2.7 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)功能特性分析

2.7.1 體外消化率分析

如圖4所示，Zn500的蛋白質(zhì)體外消化率高于其他富鋅、富硒秀珍菇樣品，但明顯低于CK，Se100的體外消化率最低，為38.61%。富鋅秀珍菇隨鋅含量的增加，體外消化率呈先減小后增大的趨勢；而富硒秀珍菇隨硒含量的增大，體外消化率呈先增大后減小的趨勢，但變化不大。該結(jié)果表明人體（或動物）在攝入等量秀珍菇后，富鋅、富硒的秀珍菇蛋白質(zhì)消化和吸收量較小。

圖4 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的體外消化率Fig.4 In vitro digestibility of proteins from zinc-enriched and selenium-enriched P.geesteranus

2.7.2 持水性及持油性分析

如圖5所示，富鋅秀珍菇蛋白質(zhì)的持水性和持油性隨著鋅含量的增大均逐漸減小，且持水性比持油性的變化?。涣硗?，富鋅秀珍菇蛋白質(zhì)的持水性及持油性均低于CK，這說明富鋅秀珍菇與CK相比，持水性能及持油性能均降低。富硒秀珍菇持油性隨著硒含量的增加而逐漸減小，且富硒秀珍菇與CK相比持油性能較差；此外，富鋅秀珍菇的持水性隨硒含量的增大，呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，同時可以看出Se100的持水性接近但小于CK。

圖5 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的持水性及持油性Fig.5 Water- and oil-holding capacity of proteins from zinc-enriched and selenium-enriched P.geesteranus

蛋白質(zhì)的持水性是蛋白質(zhì)功能特性中的一種，是指蛋白制品在一定條件下承受熱加工后保持水分的能力[31]。持油性是物質(zhì)最大限度吸附油的能力[32]。本實驗通過對CK、富鋅、富硒秀珍菇樣品的蛋白質(zhì)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行富鋅、富硒栽培后的秀珍菇蛋白質(zhì)的持水性及持油性降低。

2.7.3 起泡性及泡沫穩(wěn)定性分析

由圖6可以看出，富鋅秀珍菇蛋白質(zhì)的起泡性都比CK高，其中起泡性最高為Zn200（137.50%），并且隨著富鋅秀珍菇中鋅含量的增加，起泡性呈先減小后增大的趨勢；富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的起泡性均低于CK，起泡性最低的為Se20（66.67%），富硒秀珍菇的蛋白起泡性與硒含量呈正相關(guān)。

圖6 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的起泡性Fig.6 Foaming capacity of proteins from zinc-enriched and seleniumenriched P.geesteranus

如圖7所示，CK蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性隨著時間的延長而逐漸降低，而富鋅秀珍菇蛋白質(zhì)泡沫穩(wěn)定性的變化趨勢與CK相同，但其穩(wěn)定性比CK差。相對而言，富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性較好，Se60在30、60、90 min的泡沫穩(wěn)定性均為最高，且高于CK。電泳結(jié)果顯示富硒秀珍菇蛋白質(zhì)與富鋅樣和CK相比具有更多的大分子質(zhì)量蛋白，分子間作用力更強(qiáng)，因此具有更高的泡沫穩(wěn)定性。

圖7 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性Fig.7 Foam stability of proteins from zinc-enriched and seleniumenriched P.geesteranus

綜上所述，富鋅秀珍菇蛋白質(zhì)的起泡能力高，但泡沫穩(wěn)定性差；而富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的起泡能力較低，但泡沫穩(wěn)定性較好，這也驗證了蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力越強(qiáng)，泡沫穩(wěn)定性越弱，兩者通常是相反的這一說法。

2.7.4 乳化性及其穩(wěn)定性分析

由圖8所示，富鋅秀珍菇蛋白質(zhì)的乳化性隨著鋅含量增加而逐漸上升，并且其乳化性與乳化穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，其中Zn500的乳化性最高。與富鋅秀珍菇蛋白質(zhì)不同，富硒秀珍菇蛋白質(zhì)在硒含量逐漸增大時，其起泡性呈先減小后增大的趨勢，并且所有富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的乳化性都優(yōu)于CK，其中Se100的乳化性最高，乳化穩(wěn)定性與乳化性變化趨勢一致。Zn200和Se20的乳化穩(wěn)定性最高，優(yōu)于CK和其他鋅、硒濃度的秀珍菇蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性。

圖8 富鋅、富硒秀珍菇蛋白質(zhì)的乳化性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）Fig.8 Emulsifying capacity (A) and emulsion stability (B) of proteins from zinc-enriched and selenium-enriched P.geesteranus

3 討論與結(jié)論

鋅、硒含量對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能有一定影響，適宜的鋅、硒添加量栽培可以提高秀珍菇蛋白質(zhì)的含量。硒通過取代硫原子與半胱氨酸和蛋氨酸結(jié)合，形成硒代氨基酸化合物從而結(jié)合到蛋白質(zhì)上，鋅則與巰基形成配位鍵結(jié)合到蛋白上，鋅、硒和蛋白的結(jié)合造成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化，對蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生了影響。鋅、硒與蛋白質(zhì)的結(jié)合造成蛋白質(zhì)中二硫鍵減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降低蛋白質(zhì)亞基之間的結(jié)合力會對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時會降低蛋白質(zhì)亞基之間的結(jié)合力，使維系蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的非共價鍵作用力，如分子之間的疏水相互作用、分子間的靜電相互吸引或排斥作用等受到影響[33]，蛋白質(zhì)亞基解離，小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)比例提高。

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和分子間相互作用力是蛋白質(zhì)功能特性的主要影響因素，受鋅、硒結(jié)合量影響產(chǎn)生不同變化，其變化也會不同程度地改變秀珍菇蛋白質(zhì)的功能特性。鋅、硒含量增加不利于秀珍菇蛋白質(zhì)的持水性和持油性及其消化，但能優(yōu)化其乳化性質(zhì)，適宜的鋅、硒濃度可以提高秀珍菇蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性。鋅含量升高可提高秀珍菇蛋白質(zhì)的起泡性，但不利于其穩(wěn)定性，富硒秀珍菇則相反。秀珍菇蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的改變主要是由于不同含量的鋅、硒與蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能特性。

WS/T 578.3—2017《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量 第3部分微量元素》中規(guī)定，鋅的推薦攝入量為成人12.5 mg/d（男），7.5 mg/d（女），可耐受最高攝入量為40 mg/d；硒的推薦攝入量為成人60 μg/d，可耐受最高攝入量為400 μg/d。按照此標(biāo)準(zhǔn)，富鋅秀珍菇每天攝入100 g（干基）以下是適宜和安全的。由于秀珍菇對硒具有強(qiáng)富集能力，在20～100 mg/kg硒添加量下栽培，富硒秀珍菇硒含量可達(dá)100 mg/kg以上，可作為富硒食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑開發(fā)利用。通過栽培適宜濃度的富鋅、富硒食用菌，研究其蛋白質(zhì)及多糖等組成物質(zhì)的性質(zhì)以獲得富鋅、富硒食用菌的功能產(chǎn)品，對發(fā)展富鋅、富硒食用菌產(chǎn)業(yè)具有重要的推動作用。