NO對宰后牛肉成熟過程中AMPK活性、糖酵解及持水力的影響

李 喬，馬紀兵，余群力*，韓 玲

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated proteinkinase，AMPK）在動物宰后糖酵解過程中起非常重要的調(diào)節(jié)作用，其主要方式是調(diào)控糖酵解中的己糖激酶（hexokinase，HK）加速糖酵解[1]。糖酵解是宰后能量變化中一個重要過程，葡萄糖經(jīng)過此反應(yīng)最終被分解為乳酸[2-3]，乳酸積累使pH值下降，而pH值是影響肉品品質(zhì)的重要因素。持水力對于肉品品質(zhì)也十分重要，是評價肉品質(zhì)量的必要性指標之一[4]，離心損失可以判斷肉的持水力。目前已有研究證明AMPK能夠調(diào)節(jié)糖酵解并影響牛肉的保水性能。高永芳等[5]報道，牛肉宰后成熟過程中AMPK激活劑可以提高肌肉AMPK活性，加快糖酵解使牛肉保水性變差。朱立賢等[6]研究發(fā)現(xiàn)，宰后早期較高溫度可以提高牛背最長肌的AMPK活性并加速糖酵解，增大貯藏損失。

NO作為一種氣體信號分子廣泛存在于肌肉組織內(nèi)，參與調(diào)節(jié)機體生理活動[7]。在生理或病理條件下提高一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）活性，可以增加NO的合成，從而誘導(dǎo)激活A(yù)MPK[8-10]。Xie Zhonglin等[11]發(fā)現(xiàn)NO可以和O2－組合形成ONOO－，其可以增加牛主動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)AMPK的磷酸化。李巖等[12]報道H2S可以增加內(nèi)皮細胞NO的合成，隨著NO減少AMPK活性也明顯降低。Calvert等[13]研究發(fā)現(xiàn)在敲除NOS的鼠內(nèi)皮細胞內(nèi)，AMPK的激活劑不能激活A(yù)MPK，說明內(nèi)源性NO在激活A(yù)MPK中具有重要作用。但是，針對牛肉宰后NO對AMPK，糖酵解及肉質(zhì)是否有級聯(lián)調(diào)控作用卻鮮見報道，動物宰后NO是否通過激活A(yù)MPK進而調(diào)控糖酵解尚不明確，因此探討牛肉宰后NO對AMPK、糖酵解和肉品質(zhì)的級聯(lián)調(diào)控作用對發(fā)掘宰后牛肉品質(zhì)劣變內(nèi)源因素具有重要意義。

因此，本實驗探討宰后牛肉成熟72 h過程中NO對AMPK活性、糖酵解速率以及肌肉持水力的影響，并闡明NO對AMPK活性、糖酵解以及肉品質(zhì)之間的級聯(lián)調(diào)控機制。將對發(fā)掘影響宰后牛肉品質(zhì)的內(nèi)源調(diào)控因子并以此作為調(diào)控靶點進而改善肉品質(zhì)具有積極促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

肉樣取自甘肅康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團有限公司。選取生長發(fā)育正常、健康無病、平均年齡3～4 歲的西門塔爾雜交公牛6 頭，體質(zhì)量（600±30）kg。參考國內(nèi)外對動物福利的相關(guān)要求，嚴格按照GB/T 19477—2018《畜禽屠宰操作規(guī)程牛》屠宰方式進行操作，屠宰放血后（45 min內(nèi)）在每頭牛胴體上取下約300 g臀股四頭肌，剔除表面脂肪和結(jié)締組織并切割成2 cm×2 cm×1 cm的肉塊（約5 g），隨機分為4 組，每組約400 g肉樣，均勻地用20 G針穿刺后與相應(yīng)溶液1∶1（g/mL）混合浸泡。4 個處理組分別是：1）NO促進組，10 mmol/L二乙烯三胺（diethylenetriamine，DETA）；2）NO抑制組，20 mmol/L亞硝基左旋精氨酸甲酯（L-nitro-arginine methyl ester，L-NAME）；3）對照組，0.86% NaCl；4）NO促進+AMPK抑制組，10 mmol/L DETA+40 μmol/L Compound C（AMPK抑制劑）。樣品在4 ℃下浸泡12 h后取出，用濾紙吸取表面水分，然后在4 ℃成熟0、6、12、24、48、72 h。在成熟時間點取樣并測定pH值和離心損失，對于其他不便立即測定的指標存放在－80 ℃超低溫冰箱待用。其中，1、2、3組用于測定分析NO含量、NOS活性、AMPK活性；1、2、3、4組用于測定分析pH值、蛋白溶解性、離心損失、糖酵解酶活性等指標，每個指標測定至少重復(fù)3 次。

1.1.2 試劑

牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、NO測定試劑盒、總NOS（T-NOS）測定試劑盒、HK試劑盒、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）試劑盒、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；NaCl、雙縮脲、二亞乙基三胺、N-硝基-L-精氨酸甲酯 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004B型電子天平 上海佑科儀器有限公司；5417R型低溫臺式冷凍離心機 德國Eppendorf生物公司；DW-86L828型超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司；HI99163型便攜式pH計 意大利哈納HANNA儀器公司；SP-756P型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；SPectramax M2型酶標儀 美國美谷分子儀器有限公司；XHF-DY型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；離心管 安徽Biosharp公司。

1.3 方法

1.3.1 NOS活性、NO含量測定

取肉樣約1 g左右，放入50 mL離心管中，按1∶9（g/mL）加入冷卻勻漿介質(zhì)（0.86%生理鹽水），10 000 r/min冰浴勻漿30 s，勻漿2～3 次。然后4 ℃、4 000 r/min離心10～15 min，棄沉淀取上清液進行測定。測定NOS活性和NO含量時肉樣前期處理一致，具體操作步驟和計算公式分別參照南京建成試劑盒說明書進行。

1.3.2 AMPK活性測定

參考Underwood等[14]的方法，取肉樣0.6 g左右于10 mL離心管中，1∶5（g/mL）加入冷凍勻漿液，3 000 r/min冰浴勻漿。然后4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液進行測定。操作步驟及計算參照南京建成試劑盒說明書進行。

1.3.3 糖酵解酶活性測定

HK、PFK、PK、LDH活性的測定均采用南京建成試劑公司試劑盒，具體操作和計算參照各試劑盒的說明書。

1.3.4 pH值測定

參考Bee等[15]的方法。隨機選擇3 個不同部位，將便攜式pH計的探針插入其中，與肌肉保持良好接觸，待“Not Stable”字樣消失后，讀取數(shù)值，計算取平均值。

1.3.5 蛋白溶解性

肌漿蛋白質(zhì)溶解性：參照Joo等[16]的方法測定。取1 g肉樣加入50 mL離心管中，加入10 mL冷凍0.025 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.2），冰浴條件下10 000 r/min勻漿30 s，勻漿2～3 次，4 ℃振蕩抽提12 h。然后進行離心處理（1 500 r/min、4 ℃、20 min），取上清液用雙縮脲法測定其蛋白含量。

總蛋白質(zhì)溶解性：取1 g肉樣加入50 mL離心管中，加入20 mL經(jīng)預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.2），其中含有1.1 mol/L碘化鉀溶液，冰浴條件下10 000 r/min勻漿30 s，勻漿2～3 次，4 ℃振蕩抽提12 h。然后進行離心處理（1 500 r/min、4 ℃、20 min），將上清液用雙縮脲法測定其蛋白含量。肌原纖維蛋白溶解性按式（1）計算：

1.3.6 離心損失

參考Zhang Wangang等[17]的方法并稍作修改。將宰后成熟0～72 h的肉樣分別切成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm的長條形，稱其質(zhì)量m1，放入10 mL離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄上清液，吸取表面水分稱其質(zhì)量m2，按式（2）計算離心損失率W：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各項指標至少重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)全部采用Microsoft Excel 2010計算±s，用SPSS 21.0進行Duncan差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），Origin 9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NOS活性、NO含量測定結(jié)果

動物宰后，肌細胞會在缺血、缺氧等應(yīng)激條件下激活NOS產(chǎn)生NO[18]。由圖1A可知，隨著宰后成熟時間的延長，NOS活性呈減小趨勢，對照組0 h NOS活性低于DETA組28.36%，高于L-NAME組52.24%。0、6、12 h對照組NOS活性顯著高于L-NAME組（P＜0.05），顯著低于DETA組（P＜0.05）。由圖1B可知，DETA組NO含量先增大后減小，在6 h達到最大，6 h對照組低于DETA組13.75%，高于L-NAME組12.5%。6、12 h對照組NO含量顯著高于L-NAME組（P＜0.05），顯著低于DETA組（P＜0.05）；6、12、24、48、72 h DETA組NO含量顯著高于L-NAME組（P＜0.05）。以上結(jié)果說明宰后牛肉成熟過程中DETA處理提高了牛肉的NO水平，L-NAME能夠抑制NOS活性從而降低NO含量。Li Yunpin等[19]研究NO對宰后豬肉蛋白質(zhì)的影響時使用DETA和L-NAME分別促進NO釋放和抑制NOS活性，本實驗結(jié)果與之一致。

圖1 宰后成熟過程中NOS活性和NO含量的變化Fig.1 Changes in NOS activity and NO content during postmortem aging

2.2 AMPK活性和肌肉糖酵解水平分析

AMPK與宰后機體能量代謝有著密切聯(lián)系，是能量穩(wěn)態(tài)重要的感受器和調(diào)節(jié)器，AMPK活性的高低可以影響宰后糖酵解的速度和程度[20]。由表1可知，隨著成熟時間的延長，3 個處理組的AMPK活性先增大后減小。AMPK活性在0、6、12 h對照組顯著高于L-NAME組（P＜0.05），顯著低于DETA組（P＜0.05）。L-NAME組在0 h AMPK活性分別低于對照組和DETA組17%、27%，在72 h分別低于對照組和DETA組8%、15%。Zhang Junhua等[21]研究，將靜脈內(nèi)皮細胞暴露于NO供體，增加了內(nèi)皮細胞中AMPK Thr-172磷酸化水平和AMPK活性；James等[22]報道，血管內(nèi)皮生長因子在Ser1177位點磷酸化或激活內(nèi)皮細胞NOS可以促使NO產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)激活A(yù)MPK。本研究AMPK活性L-NAME組低于對照組和DETA組與之類似，說明宰后牛肉成熟前期NO對AMPK有激活作用，但是具體的激活途徑還需進一步研究。

表1 宰后成熟過程中AMPK活性和糖酵解酶活性的變化Table 1Changes in AMPK activity and glycolytic enzyme activity during postmortem aging

大量研究表明AMPK被激活后可以促進糖酵解的發(fā)生，其主要方式是調(diào)控糖酵解中的關(guān)鍵酶[1]。由表1可知，隨著成熟時間延長HK活性降低，PFK活性先增大后減小，2 種酶活性在6、12 hL-NAME組顯著低于對照組和DETA組（P＜0.05）。HK活性在0 h為最大值，PFK活性在6 h達到最大值，總體的PFK達到活性最大值的時間比HK延遲了6 h左右，推測原因可能是PFK是由HK的某些反應(yīng)產(chǎn)物激活，這與Holmes等[23]的結(jié)果相一致，在老鼠骨骼肌中注射AMPK激活劑，顯著提高了HK活性進而加速了糖酵解進程。此外，DETA+Compound C組HK活性和PFK活性在0、6、12 h顯著低于其他3 組（P＜0.05），用Compound C抑制AMPK活性后，糖酵解速率也會受到抑制[24]。從表1可以看出，PK、LDH活性均呈下降趨勢，但L-NAME組和DETA組與對照組均無顯著差異（P＞0.05）。以上4 種酶活性的變化表明，牛肉宰后成熟早期NO通過調(diào)控AMPK活性影響糖酵解速率，在這一過程中HK和PFK是AMPK促進糖酵解速率的關(guān)鍵酶。

動物宰后糖酵解速率和程度是影響機體pH值的主要因素。pH值是評價肉品質(zhì)的重要指標，pH值的變化能直接反映出宰后機體的能量代謝情況，會影響肌肉蛋白特性進而影響肉質(zhì)[25]。由圖2可知，隨著成熟時間的延長，L-NAME組、對照組和DETA+Compound C組的pH值均呈減小趨勢，但是DETA組pH值先減小后增大，在48 h提前降到最低點5.25，下降速率最大。在6、12、24 h，L-NAME組pH值顯著高于對照組和DETA組（P＜0.05），推測原因是L-NAME抑制NO釋放對AMPK的激活作用減弱，減慢糖酵解速率，使得pH值高于對照組和DETA組。楊雅媛等[26]發(fā)現(xiàn)宰后牦牛肉成熟過程中AMPK活性最大，糖酵解速率最快，乳酸質(zhì)量濃度最大，pH值最低。DETA+Compound C組在6、12、24 h顯著高于其他3 組（P＜0.05），進一步證明NO是通過激活A(yù)MPK促進糖酵解速率降低pH值。以上結(jié)果說明宰后牛肉成熟前期NO可以提高AMPK活性加速糖酵解使肌肉pH值降低。

圖2 宰后成熟過程中pH值的變化Fig.2 Changes in pH during postmortem aging

2.3 蛋白溶解性和牛肉離心損失分析結(jié)果

動物宰后肌肉中蛋白溶解性是蛋白變性的重要指標之一，與pH值和保水性緊密聯(lián)系。蛋白溶解性越高，蛋白結(jié)合水的能力就越強，肉的保水性也越好。由圖3A可知，隨著宰后成熟時間延長，總蛋白溶解性降低，0、6、12、24、48、72 hL-NAME組顯著高于對照組（P＜0.05），6、12、24、48、72 h DETA+Compound C組顯著高于其他3 組（P＜0.05）；圖3B中肌原纖維蛋白溶解性降低，6、12、24 hL-NAME組顯著高于對照組（P＜0.05），DETA+Compound C組顯著高于其他3 組（P＜0.05），推測原因可能是NO激活A(yù)MPK促進糖酵解使得pH值降低，低pH值導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性使其溶解性降低。圖3C肌漿蛋白呈增大趨勢，0、6、12、24、48、72 hL-NAME組顯著高于對照組（P＜0.05），可能是因為宰后短時間內(nèi)肉樣的pH值變化，使得肌漿蛋白重鏈發(fā)生部分伸展和重新折疊，部分表面疏水基團暴露和伸展，導(dǎo)致其界面活力增加，乳化能力提高，溶解度增加[27]。牛肉宰后相同成熟時間點上，L-NAME組總蛋白溶解性大于對照組，DETA+Compound C組總蛋白溶解性大于L-NAME組和對照組，由此可見，NO通過AMPK促進糖酵解進而影響pH值和蛋白溶解性。

圖3 宰后成熟過程中蛋白溶解性的變化Fig.3 Changes in protein solubility during postmortem aging

離心損失作為衡量肉品持水力的重要指標之一，受pH值和蛋白溶解性變化的影響[28]。圖4中離心損失呈先增大后減小趨勢，6、12、24、48 hL-NAME組顯著低于對照組和DETA組（P＜0.05），DETA+Compound C組顯著低于其他3 組（P＜0.05），這種差異可能是宰后早期NO提高AMPK活性加速糖酵解使得pH值降低，變性蛋白溶解性下降進而導(dǎo)致離心損失增大。當?shù)鞍踪|(zhì)受低pH值影響變性后，特別是維持細胞骨架的連接蛋白變性會導(dǎo)致汁液損失增大[29]。pH值降低至蛋白等電點后，蛋白質(zhì)的正負電荷相等，蛋白質(zhì)相互吸引，靜電荷為零，降低了對水分的吸引，也會造成水分流失。Joo等[16]探討豬背最長肌蛋白溶解性與其保水性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)pH值越低蛋白溶解性越小，保水性越差。牛肉宰后相同成熟時間點，離心損失L-NAME組低于對照組，DETA+Compound C組低于L-NAME組和對照組，說明NO通過激活A(yù)MPK促進糖酵解速率加快與乳酸積累，pH值下降使蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致肉的離心損失變大，持水性變差。

圖4 宰后成熟過程中離心損失的變化Fig.4 Changes in centrifugal loss during postmortem aging

2.4 相關(guān)性分析

由表2可知，L-NAME組AMPK活性變化與NO含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），DETA組和對照組AMPK活性變化與NO含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。Higaki等[30]用NO供體對大鼠骨骼肌處理增加了AMPK活性，證明NO含量與AMPK活性呈正相關(guān)關(guān)系；HK活性變化、PFK活性變化、L-NAME組和對照組pH值與AMPK活性變化表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)（P＜0.01），DETA組pH值與AMPK活性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。AMPK活化后可以促進糖酵解[31]，Du Min等[32]報道宰后AMPK會加速糖酵解使肌肉的pH值快速下降；總蛋白溶解性與pH值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），離心損失與總蛋白溶解性和pH值分別呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01）。有研究表明汁液損失與蛋白變性呈顯著負相關(guān)[33]，在?？颂m等[34]的研究中汁液損失與pH值呈負相關(guān)，而總蛋白溶解性與pH值為正相關(guān)關(guān)系。推測原因是NO激活A(yù)MPK增強HK、PFK活性促進糖酵解速率，乳酸累積，pH值降低，蛋白質(zhì)變性，使其溶解性下降進而導(dǎo)致汁液損失率增大[35]。宰后pH值降低是肉的保水性變差的主要原因，Melody等[36]研究顯示pH值的變化會引起蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致水合能力下降，肌肉保水能力隨之下降。結(jié)果表明，NO可以提高AMPK活性促進糖酵解速率使pH值下降，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性溶解度降低，最終使肉的離心損失增大持水力下降。

表2 各指標間的Pearson相關(guān)系數(shù)（r）Table 2Pearson correlation coefficients (r) among various indicators and significance test

3 結(jié) 論

受宰后僵直作用的影響，在宰后成熟72 h前牛肉的持水能力降低。然而，在此階段肌肉中的NO促進了AMPK的激活，活化的AMPK通過增強HK和PFK活性加快糖酵解速率進一步使pH值快速降低，導(dǎo)致肌肉的pH值過早接近蛋白質(zhì)等電點而降低了蛋白質(zhì)的溶解性和肌肉的持水能力。因此，可以將NO對AMPK的調(diào)節(jié)途徑作為一個重要的調(diào)控靶點，并以此改善牛肉在成熟過程中的持水能力和肉品質(zhì)。