侵襲性真菌疫苗的免疫抑制造模及免疫指標研究

陳 勉，袁丹丹，牛林林，陳 磊，邵華榮，張曉元，張艷艷，劉 飛, ，凌沛學, ，陳 凱

（1. 山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室 博士后科研工作站，山東 濟南 250101；2. 山東大學藥學院，山東 濟南 250101；3. 東阿生力源阿膠股份有限公司 聊城市阿膠多肽提取技術(shù)研發(fā)重點實驗室，山東 聊城 252218）

侵襲性曲霉病、侵襲性念珠菌病等侵襲性真菌感染發(fā)病率近年不斷升高[1-4]，盡管檢測水平不斷提高，如某些常見致病真菌可通過分子技術(shù)平臺實現(xiàn)特異快速檢測，達到縮短診斷時間盡早用藥目的[5]，但侵襲性真菌病的致死率仍然高達40 %。病例數(shù)呈指數(shù)級上升的金假絲酵母（Candida auris）侵襲性真菌病死亡率接近60 %[6-10]，部分罕見真菌賽多孢子菌（Scedosporium）、多育孢子蟲（Lomentospora）可達80 %[11]。死亡率高的可能原因是侵襲性真菌病的病原體為條件致病菌，個體致病菌株的早期可檢出性有不確定性，可選的治療藥物品種和策略有限[12]，也與耐藥株出現(xiàn)及侵襲性真菌病患者自身免疫抑制狀態(tài)等有關(guān)。

目前臨床抗真菌的藥物主要是唑類、兩性霉素、棘白菌素等直接抑殺體內(nèi)真菌的化學藥物，不能有效防控臨床侵襲性真菌病[13]。Ademe等[14]認為在目前的治療策略中，免疫調(diào)節(jié)和干預是近年抗侵襲性真菌病研究的重要研究方向，尤其是預防侵襲性真菌病疫苗研究[15]。隨著對真菌感染和機體應答機制的認識逐步深入，Boniche等[16]報道了動物實驗有效的候選疫苗臨床前研究。但自10年前首次開展2 ～3種抗真菌疫苗（非侵襲性真菌?。┑腎期、II期臨床研究[17-18]，至今仍沒有治療或預防侵襲性真菌感染的疫苗獲批，該方向疫苗缺乏是一個日益重要的問題[19-20]。因此，為提高臨床實驗成功率，仍需進一步加強臨床前的預防侵襲性真菌病疫苗篩選和優(yōu)化研究。

用于抗真菌感染的實驗動物模型有小鼠、果蠅、線蟲、鵪鶉蛋[21-22]等類型，但涉及免疫保護應答和真菌挑戰(zhàn)測試的主要是通過小鼠進行研究，這些哺乳動物模型更能代表人類的情況。目前預防真菌感染的模型研究，主要采用常規(guī)體液免疫和攻毒致死率、腎臟菌載量和腎臟PAS染色切片[21,23]等指標，還需不斷探索模擬臨床患者狀況的免疫抑制造模方法，建立和選擇具有針對性的免疫功能和信號通路分析指標，這對加快疫苗開發(fā)具有重要指導意義。

1 免疫抑制造模方法

包括真菌在內(nèi)的環(huán)境微生物與人體皮膚黏膜屏障、固有免疫和適應性免疫系統(tǒng)相互影響和作用，當人體免疫平衡被破壞后，會顯現(xiàn)疾病狀態(tài)。臨床發(fā)生侵襲性真菌病病因主要有醫(yī)源性治療和自身免疫低下，包括化療藥物、免疫抑制劑、廣譜抗生素、假體裝置和移植，中性粒細胞減少癥和人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV），導致在健康人群體內(nèi)共生的部分真菌侵襲發(fā)病[24]。前期的侵襲性真菌病的臨床前免疫治療實驗若在健康小鼠上進行，在功效分析時，小鼠正常的免疫功能可能被忽視，得到的部分治療有效結(jié)論的證據(jù)可能不充分，所以有必要首先研究建立免疫功能受到抑制的小鼠模型。

1.1 藥物誘發(fā)的免疫抑制

Xin[25-26]研究在接種白假絲酵母菌前3天，對小鼠腹腔注射200 mg/kg環(huán)磷酰胺；在給予真菌感染后每10天（或7天）按150 mg/kg連續(xù)注射，使首次注射后3 ～4天中性粒細胞<500 個/mm3，并持續(xù)整個實驗期間。Moser等[27]研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠單次環(huán)磷酰胺200 mg/kg腹腔注射后，外周血白細胞迅速被抑制，雖然多形核白細胞和單核細胞數(shù)量迅速反彈回正常和更高水平，而淋巴細胞在4周觀察期內(nèi)能保持被抑制狀態(tài)。Zhang等[28]按 80 mg/kg劑量給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，注射后第3，4天體重明顯下降，第10天檢測結(jié)果顯示胸腺和脾臟指數(shù)明顯下降，巨噬細胞吞噬作用降低，干擾素-γ（interferon-γ, IFN-γ）和白介素10（interleukin-10 kt,IL-10）水平升高，免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）、IgM和IgA數(shù)量減少。Singh等[29]在最后一次增強免疫后的第12天，也是真菌攻毒日的倒數(shù)第2天和攻毒后第3天，小鼠腹腔注射200 mg/kg環(huán)磷酰胺和皮下注射250 mg/kg醋酸可的松，使小鼠中性粒細胞減少。還有文獻報道單獨使用皮質(zhì)類固醇建立小鼠免疫抑制模型[30]，及從真菌攻毒日的倒數(shù)第3天直到實驗結(jié)束，每天給小鼠125 mg/kg劑量皮下注射醋酸可的松模型[25]。Wiederhold[31]在真菌感染小鼠前1天，一次性按150 mg/kg給予氟尿嘧啶，感染后第1 ～8天小鼠血液中的中性粒細胞數(shù)量<2×109個/L（最低1×109個/L）。

1.2 骨髓移植形成的免疫抑制

小鼠在骨髓移植后約3天在外周血和肺部可觀察到嚴重的中性粒細胞減少，由此可制作小鼠免疫力低下模型[32]。首先將C3H/HeJ小鼠暴露于18 mV光子束直線加速器的9 Gy單次致死劑量下，設(shè)置焦點到皮膚的距離為75 cm，劑量為0.7 Gy/min，造成骨髓抑制；然后將從DBA/2小鼠股骨和脛骨取出的骨髓，去除T細胞后，制成4×106細胞/ml懸液通過C3H/HeJ小鼠尾靜脈注射0.5 ml進行骨髓移植。

1.3 轉(zhuǎn)基因小鼠免疫抑制

Yu等[33]報道Harlan公司的Beigenu/nuXIDIII是免疫抑制裸鼠，可直接用于研究。一種具有補體途徑C5遺傳缺陷的近交系A(chǔ)/J小鼠，不需環(huán)磷酰胺誘導免疫抑制，有望成為研究金耳酵母侵襲性感染發(fā)病機制的模型，用于由真菌引起的免疫反應和篩選抗真菌疫苗研究[34]。

2 免疫功能指標

傳統(tǒng)減毒株方法制備的疫苗可能不適用免疫抑制患者，Oliveira等[18]認為開發(fā)亞單位等類型疫苗有望提高免疫抑制患者的應用安全性，但這類探索性疫苗的有效性研究需對疫苗免疫應答機制和功能有更深入認識。

2.1 細胞免疫功能

入侵機體內(nèi)環(huán)境的真菌抗原通過抗原呈遞細胞（antigen-presenting cell, APC）主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）II類分子遞呈給CD4+T輔助細胞（Th）。CD4+Th介導釋放免疫細胞因子、幫助B細胞和CD8+T細胞發(fā)揮作用，對于防御真菌病至關(guān)重要。CD4+Th細胞可進一步誘導分化為輔助型T細胞（Th1、Th17、Th2）和調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）。Th1、Th17細胞有促進炎癥反應作用，其中Th1細胞所釋放的IFN-γ和Th17細胞所釋放的IL-17在對抗真菌作用中起到關(guān)鍵作用；Th2細胞輔助B細胞活化發(fā)揮體液免疫的作用，也可加劇感染程度促進過敏反應造成宿主組織損害；Tregs是一類控制體內(nèi)自身免疫反應性的T細胞亞群，可調(diào)節(jié)機體免疫功能，協(xié)調(diào)對機體的保護/損害兩類免疫作用。Tregs的雙向調(diào)節(jié)功能也造成人體對真菌的耐受和長期感染，并且有研究顯示人體抗真菌功能的發(fā)揮并不依賴Tregs，因此本文對Tregs的功能考察從略[35]。綜上所述目前預防侵襲性真菌感染疫苗研究的關(guān)鍵技術(shù)是如何激發(fā)強烈的T細胞免疫應答。

分析具有特定表面標志性分子T細胞及相應細胞因子的水平及變化是監(jiān)測候選疫苗誘導T細胞免疫應答的重要工具，可通過酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（enzyme linked immunospot assay，ELISpot）或酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）以及流式細胞胞內(nèi)因子染色法（intracellular cytokine staining，ICS）實現(xiàn)[29,36-37]。目前在預防侵襲性真菌感染疫苗研究中，常見的T細胞亞型及所分泌的細胞因子種類見表1。

表1 考察候選疫苗對T細胞亞群作用機制的表面標志性分子和細胞因子

2.2 固有免疫吞噬功能

Ravikumar等[24]指出在機體的抗真菌過程中，巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等固有免疫系統(tǒng)的病原體識別受體（pathogenrecognition receptor，PRR）首先識別真菌細胞壁中葡聚糖、幾丁質(zhì)、甘露聚糖等病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），具有募集和發(fā)揮吞噬、定向殺滅真菌病原體，及分泌細胞因子介導炎癥反應和進行抗原遞呈等重要作用；同時發(fā)現(xiàn)巨噬細胞的抗真菌活性可被粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、IFN等細胞因子刺激而增強。Lionakis等[35]發(fā)現(xiàn)在侵襲性真菌感染過程中，巨噬細胞等吞噬細胞可通過表觀遺傳重組引起組蛋白三甲基化和乙?；?，產(chǎn)生屬于固有免疫具有記憶功能的馴化免疫。

2.2.1 巨噬細胞活性 巨噬細胞通過PAMP識別入侵真菌，主要發(fā)揮吞噬和胞內(nèi)殺滅真菌作用。Singh等[29]采用調(diào)理吞噬細胞殺滅試驗法（opsonophagocytic killing assay，OPK），培養(yǎng)小鼠RAW264.7巨噬細胞，添加1 ng/ml 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理24 h激活巨噬細胞；將活化的巨噬細胞與金耳酵母細胞以1:1比例添加至微量滴度孔，溫和搖動培養(yǎng)2 h定量接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）瓊脂平板，通過平均菌落數(shù)計算巨噬細胞對金耳酵母細胞的殺滅率。Wüthrich等[37]從小鼠肺泡灌洗液收集巨噬細胞，以105個細胞/孔的濃度于37 °C，5 % CO2培養(yǎng)3 h，洗去未貼壁的細胞，在完全培養(yǎng)基或添加IFN-γ、IL-17A/A和IL-17 A/F的培養(yǎng)基中過夜；添加感染指數(shù)達到0.01的皮炎桿菌酵母，于37 °C，5 % CO2共培養(yǎng)24 h，收集上清，并用無菌水溶解細胞。將裂解液涂布于腦心浸液瓊脂上，1周后計數(shù)菌落數(shù)。

2.2.2 中性粒細胞活性 中性粒細胞是固有免疫的主要效應細胞，可通過Toll樣受體2（Toll like receptor 2, TLR2）、TLR4、C型凝集素受體（C-type lectin receptor, CLR）、dectin-1、穿透素3（pentraxin3,PTX3）和補體受體識別真菌，釋放中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil Extracellular Traps, NET ）、細胞因子或作為調(diào)理素，高效、快速殺滅真菌。在真菌感染中，炎癥部位的中性粒細胞募集、活化和存活受Th17通路的影響[24]。收集小鼠腹膜中的中性粒細胞，按4×105個細胞/孔的濃度培養(yǎng)2 h后收集非黏附細胞；在完全培養(yǎng)基或添加刺激液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；添加測試用真菌，于37 °C，5 % CO2共培養(yǎng)4 h，收集上清并溶解細胞，涂布于腦心浸液瓊脂上培養(yǎng)計算真菌菌落數(shù)[37]。中性粒細胞對體內(nèi)不同真菌的殺傷能力有差異，如與白色念珠菌相比，人類中性粒細胞不能有效地殺死金耳酵母[40]。有發(fā)現(xiàn)脾臟酪氨酸激酶是中性粒細胞對念珠菌不同種反應的重要調(diào)節(jié)因子[41]。

2.2.3 樹突狀細胞活性 樹突狀細胞通過dectin-1、TLR2和TLR4等受體識別真菌，釋放細胞因子激活固有免疫，通過抗原遞呈促進原始T細胞向CD4+T細胞的分化[24]。

樹突狀細胞吞噬作用試驗，是將樹突狀細胞接種于96孔板，然后將熒光標記的白色念珠菌以樹突狀細胞:酵母 = 1:1的比例與樹突狀細胞混合；培養(yǎng)一段時間后加入臺盼藍猝滅未被樹突狀細胞吞噬的白色念珠菌熒光。收集細胞并通過流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡分析被吞噬的白色念珠菌[42]。樹突狀細胞殺傷試驗，是將樹突狀細胞接種后，加入50 μl 2×106ml/L白色念珠菌至第一個樹突狀細胞孔中混合，然后以1:4比例連續(xù)稀釋白色念珠菌6次分別與其余樹突狀細胞混合；同時將不與樹突狀細胞混合培養(yǎng)的白色念珠菌以平行方式稀釋作為對照組；培養(yǎng)24 h后通過顯微鏡計算每個孔中的白色念珠菌菌落數(shù)，白色念珠菌菌株的存活率=含樹突狀的菌落數(shù)/無樹突狀細胞的菌落數(shù)×100%[42]。

除此之外，有抗真菌作用的固有免疫細胞還有分泌GM-CSF的自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）細胞、介導IFN-γ依賴性殺傷的 γδT細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞[35,43]。

2.3 體液免疫功能

在Th2細胞IL-4、IL-10和IL-13等細胞因子作用下，B細胞可被活化形成漿細胞，生成和分泌大量特異性抗體，通過ELISA反應檢測抗體滴度進行研究[29]。但是真菌受宿主抗體介導的消除效果通常不及細菌，例如通過識別抗原抗體復合體Fc端信號補體可裂解消殺細菌，而真菌能抵抗這種裂解作用[44]。

3 免疫信號通路指標

抗真菌的免疫應答過程，通過宿主的模式識別受體PRRs介導激發(fā)下游信號通路，促進響應細胞因子釋放，激活吞噬、殺滅真菌等固有免疫反應，及通過抗原遞呈形成適應性免疫直接或間接調(diào)節(jié)T淋巴細胞的功能[45-49]。已知能識別真菌的PRR數(shù)量遠多于其他微生物的[50]。識別真菌的PRR的指標性受體按重要性主要有CLR、TLR和其他型。真菌表面不同多糖的疫苗相關(guān)PRR包括識別β-葡聚糖的CLR如dectin-1，TLR如TLR-2；識別甘露糖的Dectin-2/dectin-3、甘露糖受體（mannose receptor，MR）、巨噬細胞誘導的C型凝集素受體（macrophage-inducible C-type lectin，Mincle）、galectin-3、樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3-結(jié)合非整合素分子（DC-specific intercellular adhension molecular-3 grabbing nonintigrin，DCSIGN）和TLR的TLR-2/TLR-4；識別幾丁質(zhì)的MR，TLR-9和其他類的NOD樣受體（nucleotide binding oligomerization domain like receptors 2，NOD-2）[50]。

近年新發(fā)現(xiàn)的潛在靶標，如c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase 1, JNK1）通過抑制CD23表達下調(diào)宿主抗真菌的固有免疫反應，有望作為抗真菌感染的治療性靶標[51]。shCD5受真菌β-葡聚糖激活，可提高攻毒小鼠存活率，減少真菌負荷和增加靶器官白細胞浸潤[52]。E3泛素連接酶CBL-B有重要調(diào)節(jié)作用，通過CBL-B可調(diào)節(jié)巨噬細胞和樹突狀細胞的CLR信號通路，抑制CBL-B通路可增加殺傷真菌作用[53]。B細胞表面信號CD23（CLEC4）是真菌的CLR，可識別白念和曲霉細胞壁的α-甘露糖和β-葡聚糖，但不能識別隱球菌，可與FcRr形成復合物誘導NF-κB活化，產(chǎn)生抗真菌的免疫作用[54]。

總之，隨著預防侵襲性真菌感染的疫苗研究深入，更多的影響因素和隱藏的機制正在被發(fā)現(xiàn)，與防治效果關(guān)聯(lián)性更明顯的指標逐步明朗，可用的實驗動物模型和攻毒真菌種類[55]也不斷得到豐富，這些將有助于盡早快速準確篩選出適合人類預防侵襲性真菌感染的疫苗。