LC-MS/MS法測定大鼠血漿中丹參酮IIA磺酸鈉及其毒代動力學(xué)研究

王 芳，徐玲玲，劉愛明，逯海燕，劉小雨，陳 凱

（山東省藥學(xué)科學(xué)院、山東省生物藥物重點實驗室，山東 濟(jì)南 250101）

中藥丹參中提取的丹參酮IIA具有改善心肌供血、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗炎及抗氧化的藥理作用，可用于治療冠心病、腦卒中、心絞痛、急性心肌梗死等疾病，是臨床上治療心腦血管疾病的常用藥[1-3]。但是丹參酮IIA因為水溶性差，胃腸道難吸收故而臨床起效慢，后經(jīng)磺化成鹽合成丹參酮IIA磺酸鈉，制成注射劑，解決了上述問題[4-7]。

近年對丹參酮IIA磺酸鈉的研究較多[8-11]，多采用高效液相色譜法測定其制劑含量及藥代動力學(xué)方面，目前尚未見報道LC-MS/MS方法測定其含量及相關(guān)的毒代動力學(xué)研究資料。本研究擬建立一種LC-MS/MS方法測定大鼠血漿中丹參酮IIA磺酸鈉的濃度，并將其應(yīng)用于注射用丹參酮IIA磺酸鈉的毒代動力學(xué)研究，預(yù)測其在臨床長期應(yīng)用時的潛在風(fēng)險。

1 材料

1.1 試劑

乙腈（色譜純，批號：155174，F(xiàn)isher scientific）；水（Advantage A10 Milli-Q超純水機制備）；氯唑沙宗（批號：100364-201302，中國食品藥品檢定研究院）；丹參酮IIA磺酸鈉（含量：99.1 %，自制），注射用丹參酮IIA磺酸鈉（含量：98.9 %，自制）。

1.2 儀器

Agilent 1260-6430三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）。AUW-120D型電子分析天平（島津公司）；Eppendorf移液器（艾本德公司）；Advantage A10 Milli-Q超純水機（默克化工技術(shù)有限公司）；Vortex Genius 3渦旋儀（廣州儀科實驗技術(shù)有限公司）；Z216MK 高速冷凍離心機（Hermle有限公司）。

1.3 試驗動物

大鼠30只，體重170 ～220 g，年齡約6 ～8周，購買自北京維通利華實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK（京）2012-0001]。

1.4 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-SP色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），GL Sciences；流動相為水（A）與乙腈（B）；洗脫梯度為0～3 min，15 % B→95 % B；3～3.5 min，95 % B，3.5～3.51 min，95 % B→15 %B；3.51～5 min，15 % B；流速1.3 ml/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μl，進(jìn)樣器溫度8 ℃，分析時間為5 min，柱后采用1:4三通分流。

1.5 質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧-負(fù)離子；干燥氣：N2；干燥氣流速10 L/min，干燥氣壓力40 psi，干燥氣溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓4000 V。監(jiān)測方式：MRM，丹參酮IIA磺酸鈉定量離子對為m/z：373.1→357.0，內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗定量離子對為m/z：168.0→132.0。

1.6 溶液配制

精密稱取丹參酮IIA磺酸鈉10 mg置入10 ml量瓶，乙腈溶解并稀釋定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 mg/ml儲備液。平行配制2份，兩份儲備液分別用乙腈稀釋成為1，2.5，5，10，25，50，75，100 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液及1，2，40和80 μg/ml質(zhì)控溶液。儲存于2～8 ℃冰箱。

精密稱取10 mg氯唑沙宗置入100 ml量瓶，乙腈溶解并稀釋定容至刻度，配成濃度為100 μg/ml內(nèi)標(biāo)儲備液。移取1 ml置入1 L量瓶，乙腈溶解并稀釋定容至刻度，配成濃度為100 ng/ml內(nèi)標(biāo)溶液。

1.7 樣品處理

吸取“1.8”項采集的血漿樣本20 μl，加入含氯唑沙宗100 ng/ml乙腈溶液580 μl，渦旋2 min混勻，13000 r/min離心5 min，取上清100 μl，水100 μl置于96孔板中渦旋10 min混勻后，進(jìn)樣檢測。

1.8 毒代動力學(xué)

大鼠隨機分成3組，每組10只，雌雄各半，低、中、高劑量組給藥劑量分別10，20，40 mg/kg，給藥方式為靜脈推注，給藥體積均為10 ml/（kg·d）-1，連續(xù)4周每天給藥1次。采血日期為D1和D28，采血時間點：給藥前（0 h）及給藥后5，15，30 min及1，2，4，8，12 h。頸靜脈取血0.2 ml，置入預(yù)涂肝素鈉的離心管，8000 r/min離心5 min，取上層血漿，-65 ～-85 ℃保存。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 專屬性 分別取6個不同個體大鼠空白血漿，按“1.7”項操作（含氯唑沙宗100 ng/ml乙腈溶液改為純乙腈），經(jīng)分析，得空白血漿色譜圖（見圖1A）；將含250 ng/ml丹參酮IIA磺酸鈉的血漿樣本，依照“1.7”項操作（含氯唑沙宗100 ng/ml乙腈溶液改為純乙腈），經(jīng)分析，得丹參酮IIA磺酸鈉色譜圖（見圖1B）；將空白血漿，依照“1.7”項操作，經(jīng)分析，得內(nèi)標(biāo)色譜圖（見圖1C）；取給藥后2 h的血漿樣品20 μl，按“1.7”項操作，得血漿樣品色譜圖（見圖1D）。6個不同個體空白基質(zhì)在丹參酮IIA磺酸鈉出峰位置均無響應(yīng)，不干擾其定量。

圖1 丹參酮IIA磺酸鈉及內(nèi)標(biāo)代表性色譜圖

2.1.2 殘留 在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度樣品（ULOQ）后，進(jìn)樣空白大鼠血漿樣品，考察殘留。ULOQ樣品后進(jìn)樣的空白大鼠血漿樣品中在丹參酮IIA磺酸鈉出峰位置無響應(yīng)，說明殘留對丹參酮IIA磺酸鈉準(zhǔn)確定量無干擾。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按照1:9比例，用空白大鼠血漿稀釋得到100，250，500，1000，2500，5000，7500，10000 ng/ml血漿樣本，按“1.7”項操作。以丹參酮IIA磺酸鈉的濃度為橫坐標(biāo)（x），丹參酮IIA磺酸鈉與內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重為1/x2）進(jìn)行回歸運算。回歸方程為y=0.044 457x+0.087 889，r=0.9932，表明丹參酮IIA磺酸鈉在100 ～10000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取濃度為100 ng/ml血漿樣本，按“1.7”項操作，平行測定6個樣本。結(jié)果準(zhǔn)確度為99.2 %，精密度用RSD表示為9.0 %，符合生物樣本的檢測要求。

2.1.4 準(zhǔn)確度與精密度 用空白血漿將丹參酮IIA磺酸鈉質(zhì)控溶液稀釋成定量下限（100 ng/ml）、低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）4個濃度的樣本，按“1.7”項下依法操作，每一濃度6個平行樣本，3個分析批分3天進(jìn)行，以標(biāo)準(zhǔn)曲線算得待測分析物的濃度，并計算樣本的批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果見表1，批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度85 %～115 % ，精密度RSD不超過15 %。

表1 丹參酮IIA磺酸鈉的批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度與精密度

2.1.5 基質(zhì)效應(yīng)與回收率 為考察大鼠血漿中復(fù)雜基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，使用6批來自不同個體的提取后的空白大鼠血漿溶液稀釋質(zhì)控樣本溶液至低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）得到含基質(zhì)樣本，使用乙腈稀釋質(zhì)控樣本溶液至低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）得到純?nèi)芤簶颖?，通過計算計算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子考察基質(zhì)效應(yīng)。比較準(zhǔn)確度與精密度項下低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）血漿樣本與純?nèi)芤簶颖镜姆迕娣e考察回收率。結(jié)果見表2。

表2 基質(zhì)效應(yīng)與回收率

2.1.6 穩(wěn)定性考察 用空白大鼠血漿將質(zhì)控溶液稀釋成低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）3個濃度的樣本，每個濃度6份。分別考察丹參酮IIA磺酸鈉血漿樣品室溫放置5 h，-10～-30 ℃放置15 d、樣品處理后進(jìn)樣器內(nèi)8 ℃放置30 h及4個冷凍-解凍周期的穩(wěn)定性。結(jié)果見表3，丹參酮IIA磺酸鈉血漿樣品在上述儲存條件下均穩(wěn)定。

表3 丹參酮IIA磺酸鈉在不同條件下穩(wěn)定性（n=6）

2.1.7 稀釋可靠性 取1 mg/ml丹參酮IIA磺酸鈉儲備液用乙腈稀釋至800 μg/ml，取20 μl，加入180 μl大鼠空白血漿，渦旋混勻，得80 μg/ml血漿樣本。取10 μl該樣本加大鼠空白血漿190 μl渦旋混勻稀釋，平行6份，按“1.7”項操作。稀釋20倍后，測量結(jié)果準(zhǔn)確度為107.9 %，RSD為2.6 %，表明稀釋20倍可靠。

2.2 毒代動力學(xué)

采用驗證的LC-MS/MS法測定大鼠血漿中丹參酮IIA磺酸鈉的濃度，以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿藥物濃度，采用WinNonlin 6.3軟件非房室模型計算主要毒代動力學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t。結(jié)果見表4和圖2。

圖2 首次（A）、末次（B）給藥后各組丹參酮IIA磺酸鈉的平均血藥濃度-時間曲線

表4 丹參酮IIA磺酸鈉在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)參數(shù)

3 討論

注射用丹 參酮IIA磺酸鈉在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)研究尚未見報道，本研究建立了測定大鼠血漿中丹參酮IIA磺酸鈉濃度的LC-MS/MS分析方法，該法重現(xiàn)性好、靈敏度高、簡單快速，適用于檢測大鼠血漿中丹參酮IIA磺酸鈉的濃度。在方法開發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣溶劑組成對峰型有較大影響，故

采用有機溶劑蛋白沉淀后取上清加入等比例水，改善峰型。本試驗在色譜柱后采用1:4三通分流減少進(jìn)入質(zhì)譜的流動相與不分流相比，樣本響應(yīng)重現(xiàn)性得到很大提升。

大鼠一日1次、連續(xù)28 d靜脈注射丹參酮IIA磺酸鈉，連續(xù)28天給藥后，各劑量組雌雄大鼠體內(nèi)丹參酮IIA磺酸鈉暴露量較首次給藥無明顯升高，表明藥物無蓄積；毒理學(xué)結(jié)果表明，除40 mg/kg組大鼠藥后可見與受試物顏色相關(guān)的橙色尿液及稀便外，動物的體重、攝食量、臨床病理學(xué)及組織病理學(xué)檢查指標(biāo)均未見異常改變，其最大未觀察到損害作用劑量（NOAEL）為40 mg/kg。

綜上所述，本研究開發(fā)的 LC-MS/MS 法符合生物樣品分析的要求，可用于注射用丹參酮IIA磺酸鈉毒代動力學(xué)研究，通過觀察重復(fù)給予受試物后大鼠體內(nèi)暴露量與給藥劑量和時間關(guān)系，預(yù)測受試物在應(yīng)用時的潛在風(fēng)險，為其臨床前研究奠定了基礎(chǔ)[11-13]。