HPLC-ELSD 法測定不同品系金線蓮中金線蓮苷的含量

黃曉萱，張嘉嘉，楊 漪，林 羽，張 勛

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

金線蓮為蘭科植物花葉開唇蘭［Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.］的干燥全草，為閩臺特色藥材［1］。 金線蓮性平，味甘，歸肺、肝、腎、膀胱經(jīng)，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕的功效，主治腎炎、膀胱炎、糖尿病、支氣管炎、小兒急驚風(fēng)等病癥［2］。 金線蓮苷為金線蓮主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明金線蓮苷具有降血糖［3］、降血脂［4］、保肝護(hù)肝［5］和改善骨質(zhì)疏松［6］等作用。 課題組前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)：福建金線蓮具有多種不同外觀性狀，形成不同品系，包括大圓葉、小圓葉、尖葉等［7］。 金線蓮中金線蓮苷含量的測定方法已有相關(guān)報(bào)道，但目前為止尚少有對不同品系金線蓮的金線蓮苷含量的分析評價(jià)。 本研究擬通過高效液相色譜聯(lián)合蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）方法實(shí)現(xiàn)對不同品系金線蓮的金線蓮苷含量測定，以期為金線蓮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供一定的參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀、Alltech 3300 蒸發(fā)光散射檢測器（美國GRACE 公司）；萬分之一 AR224CN 電子天平、十萬分之一EX225DZH 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MILLI-Q Direct16 超純水機(jī)（美國 Millipore公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 金線蓮苷對照品（上海同田生物技術(shù)有限公司，批號：18081329）；甲醇、乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；色譜乙腈（上海默克化工技術(shù)有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水采用自制二次蒸餾水。 種植金線蓮18 批，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪教授鑒定為 Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.的全草，樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取金線蓮苷對照品適量，加入甲醇超聲溶解，定容配制成金線蓮苷對照品溶液（即每1 mL 含2.012 mg 的金線蓮苷），于4 ℃冰箱保存，備用。

2.2 色譜柱的優(yōu)化 分別考察了Uitimate?HPLC NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和 Waters XBridge?BEH Amide 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對色譜峰的分離效果，結(jié)果Uitimate?HPLC NH2色譜柱基線平穩(wěn)，色譜峰峰型尖銳且無裂峰出現(xiàn)，故選擇此色譜柱來分析樣品。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱：Uitimate?HPLC NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水（85∶15）；流速：1.0 mL／min；霧化室溫度：70 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；載氣為高純度氮?dú)?，氮?dú)饬魉伲?.5 L／min；增益值：8。

2.4 提取條件的優(yōu)化 精密稱取金線蓮樣品粉末約0.15 g，于50 mL 具塞三角燒瓶中，在超聲功率350 W，頻率50 kHz 條件下，考察不同提取溶劑的提取效果，分別考察了純水、甲醇（20%、40%、60%、80%、100 %）、乙醇（20 %、40 %、60 %、75 %、95 %）的提取率，結(jié)果40 %甲醇的提取效率最高。 此外，對最佳提取時(shí)間（10、15、20、25、30 、40 min）和提取溶劑用量（20、30、40、50、60 mL）進(jìn)行考察，選擇提取溶劑用量50 mL， 超聲提取15 min 作為提取條件。取18 批金線蓮樣品粉末，按上述最佳提取條件提取，放冷，0.45 μm 濾膜濾過，即得供試品溶液。精密吸取40 %甲醇、 對照品和供試品溶液各10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，理論塔數(shù)按金線蓮苷峰計(jì)＞3 000。40 %甲醇、對照品和供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 40 %甲醇、對照品及供試品溶液色譜圖

2.5 線性關(guān)系 取“2.1”項(xiàng)下的金線蓮苷對照品溶液，逐級稀釋至 804.80、562.38、337.43、202.46、121.47、72.88、43.73 μg／mL，按“2.3”項(xiàng)下的色譜方法測定峰面積。以峰面積積分值（mAU）的對數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），對照品的進(jìn)樣量（μg）的對數(shù)值為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得金線蓮苷線性回歸方程：Y＝1.3370X＋7.384 9（r＝0.999 8），表明金線蓮苷進(jìn)樣量在0.437～8.048 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取金線蓮樣品（批號20180518-2） 1 份，按“2.4”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次測定日內(nèi)精密度，連續(xù)3 d 測定日間精密度。日內(nèi)精密度RSD 為1.2 %，日間精密度RSD為2.7 %，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取金線蓮樣品（批號20180518-2） 1 份，按“2.4”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，置于室溫 0、2、4、6、8、12、24 h 后，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定金線蓮苷的峰面積，計(jì)算金線蓮苷含量。 含量RSD 小于3.0 %，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取金線蓮樣品（批號20180518-2） 6 份，按“2.4”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下測定金線蓮苷的峰面積，計(jì)算金線蓮苷含量。 含量RSD 為1.1 %，表明此方法具有良好的重復(fù)性。

2.6.4 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的金線蓮樣品（批號 20180518-2，含量 25.24 %） 0.075 g，按低、中、高濃度（約相當(dāng)于0.075 g 樣品中所含金線蓮苷量的50 %、100 %、150 %）添加金線蓮苷對照品溶液。 每個(gè)濃度溶液按“2.4”項(xiàng)下制備方法平行制備3 份，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。 結(jié)果低、中、高濃度添加的加樣回收率（n＝3）分別為 93.22 %、94.89 %、97.22 %，RSD 分別為1.8 %、1.6 %、2.0 %，平均加樣回收率為95.11 %，RSD 為2.6 %，表明該方法回收率良好。

2.7 含量測定 將樣品按照“2.4”項(xiàng)下制備方法制成供試品溶液，并按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜分析，得到結(jié)果運(yùn)用“2.5”項(xiàng)中方程計(jì)算，測得金線蓮苷含量。 見表2。

表2 樣品金線蓮含量測定結(jié)果

3 討 論

本研究測定了尖葉、大圓葉、小圓葉3 個(gè)不同品系金線蓮中金線蓮苷含量，3 個(gè)品系均含有金線蓮苷成分。 尖葉品系金線蓮苷含量范圍為22.47%～24.65%，均值為23.41%；大圓葉品系金蓮苷含量范圍為22.73%～27.02%，均值為25.17%；小圓葉品系中金線蓮苷含量范圍為19.39%～23.09%， 均值為21.14%。 同一品系各批次金線蓮苷含量相差較大，可能與種苗來源、產(chǎn)地等因素有關(guān)。 不同品系種植金線蓮間的金線蓮苷含量相差不大。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD 法，實(shí)現(xiàn)對不同品系金線蓮中金線蓮苷含量的測定，該方法簡便、可靠、準(zhǔn)確，可為金線蓮的質(zhì)量評價(jià)提供參考。