補(bǔ)腎疏肝法對(duì)卵巢早衰大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的影響

王 洋，陳姝婷，朱景茹，卓澤偉，張 斐，王維斌，郭明章

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

卵巢早衰（primary ovarian failure，POF）是指 40 歲之前女性由于各種原因?qū)е侣殉矁?nèi)卵泡破壞或耗竭從而發(fā)生卵巢功能衰竭，以促性腺激素升高、雌激素水平降低為特征的一類疾病， 臨床以月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、潮熱、盜汗、陰道干澀等為主要表現(xiàn)［1-2］。 中醫(yī)并無(wú)POF 病名，根據(jù)其癥狀歸屬于“月經(jīng)量少”“經(jīng)閉”“血枯”“不孕”等范疇［3］。西醫(yī)認(rèn)為 POF 的發(fā)生主要與遺傳、自身免疫、代謝及醫(yī)源性損傷有關(guān)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為POF 主要責(zé)之于腎精氣虧虛，肝郁氣滯，以致沖任虧虛，血海無(wú)源，發(fā)為本?。?］。有研究表明腎虛肝郁是造成卵巢早衰的主要病機(jī)［5-6］，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察補(bǔ)腎疏肝法對(duì)POF 大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)節(jié)作用以及對(duì)性激素的影響，以期為POF 的臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡SPF 級(jí)雌性SD 大鼠共24 只，體質(zhì)量150～180 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證批號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。 大鼠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 屏障系統(tǒng)，控制溫度（24±2） ℃，濕度（55±10） %，自由攝食飲水，合格證編號(hào)：20170005005273。

1.2 藥物 補(bǔ)腎疏肝方為左歸飲合柴胡疏肝散合方，處方：熟地黃 9 g，山藥 6 g，枸杞子6 g，茯苓4.5 g，山茱萸 6 g，柴胡 6 g，制陳皮 6 g，白芍 4.5 g，枳殼 4.5 g，川芎 4.5 g，醋香附 4.5 g，炙甘草 4.5 g。中藥飲片均由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院藥劑科提供，煎煮兩遍后用無(wú)菌紗布過(guò)濾3 次，濃縮至含生藥量0.693 g／mL 的湯劑。

1.3 試劑及儀器 環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)有限公司，批號(hào)：S30563）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20201016）；大鼠卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、促性腺激素釋放激素（GnRH）、促性腺激素釋放激素受體（GnRH-R）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：M00272、ML002871、ML003375、ML003038）；RM2245 型切 片 機(jī) （德 國(guó)Leica 公司）；Rayto RT-6100 酶標(biāo)分析儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

2 方 法

2.1 分組與造模 將24 只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和補(bǔ)腎疏肝組，每組8 只。 除空白對(duì)照組外，其余 2 組以 50 mg／（kg·d）的首負(fù)荷劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，再以 8 mg／（kg·d）環(huán)磷酰胺連續(xù)腹腔注射14 d，建立POF 大鼠模型。

2.2 給藥方法 按照人與動(dòng)物劑量常規(guī)換算法，即大鼠給藥劑量為人的6.3 倍計(jì)算，補(bǔ)腎疏肝組予補(bǔ)腎疏肝方湯劑 10 mL／（kg·d）灌胃，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組予等體積生理鹽水灌胃，每日1 次，共4 周。

2.3 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食禁水12 h 后麻醉，剖腹取腹主動(dòng)脈血，斷頭處死。 將卵巢周?chē)闹竞徒Y(jié)締組織都剝離干凈，清洗卵巢殘血，將其置于4%多聚甲醛溶液固定后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?全血在室溫下靜置 3 h 后，3 000 r 離心 20 min， 抽提血清，分裝凍存于-20 ℃冰箱備用。

2.4 卵巢組織病理形態(tài)觀察 卵巢組織進(jìn)行梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片、拷片，經(jīng)脫蠟、HE 染色、水化、封片后，在光鏡下觀察3 組大鼠卵巢病理形態(tài)學(xué)變化。

2.5 血清 GnRH、GnRH-R、FSH、E2檢測(cè) 上述備用血清按照相應(yīng)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作后放入酶標(biāo)儀，用450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度（OD 值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本實(shí)際濃度，檢測(cè)GnRH、GnRH-R、FSH、E2水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（）表示，采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 3 組大鼠卵巢組織病理形態(tài) 空白對(duì)照組卵巢組織結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)各級(jí)卵泡，顆粒細(xì)胞層次多；模型對(duì)照組卵巢組織體積減小，內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，閉鎖卵泡增多，成熟卵泡少；補(bǔ)腎疏肝組卵巢組織體積減小有所改善，閉鎖卵泡減少，可見(jiàn)各級(jí)卵泡。 見(jiàn)圖1。

3.2 3 組大鼠 GnRH、GnRH-R、FSH、E2水平比較見(jiàn)表1。

圖1 3 組大鼠卵巢組織HE 染色圖（×100）

表 1 3 組大鼠 GnRH、GnRH-R、FSH、E2 水平比較（）

表 1 3 組大鼠 GnRH、GnRH-R、FSH、E2 水平比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，1） P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組補(bǔ)腎疏肝組GnRH-R／（pg／mL）1567.83±154.52 564.90±184.031）752.49±169.172）n 8 8 8 GnRH／（mIU／mL）42.68±7.92 100.09±5.111）80.16±4.402）FSH／（IU／L）5.66±0.83 12.41±0.811）9.50±0.852）E2／（pmol／L）62.59±6.24 24.30±3.541）38.45±7.583）

4 討 論

目前卵巢早衰的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上缺乏統(tǒng)一的治療標(biāo)準(zhǔn)。 中醫(yī)強(qiáng)調(diào)“整體觀念”與“辨證論治”，從多角度、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)靈活運(yùn)用中藥，具有獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)和廣闊的運(yùn)用前景［7］。 中醫(yī)認(rèn)為卵巢具有“藏泄”的雙重功能，功能發(fā)揮主要依靠腎的封藏與肝的疏泄作用，腎精虧虛、肝失疏泄是卵巢早衰的主要病機(jī)［8-9］，因此，補(bǔ)腎疏肝法是防治POF 的關(guān)鍵。 補(bǔ)腎疏肝方由左歸飲合柴胡疏肝散組成。 左歸飲具有滋陰填精的功效，主治真陰不足證；柴胡疏肝散功能疏肝理氣，活血止痛，主治肝氣郁滯證。 二者合用，滋陰填精，疏肝行氣。

下丘腦-垂體-卵巢軸能夠調(diào)節(jié)女性的性激素水平，從而維持正常的生殖功能。 GnRH 由下丘腦分泌，GnRH-R 作為G 蛋白耦聯(lián)受體家族中的一員，可以介導(dǎo)GnRH 活性來(lái)調(diào)控垂體中FSH 的合成與分泌，使其到達(dá)卵巢后可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞分泌E2，促進(jìn)子宮內(nèi)膜向增殖期轉(zhuǎn)變，加速卵巢卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟以及排卵［10-11］。 FSH 是臨床常見(jiàn)的反映卵巢功能的指標(biāo)，E2水平升高對(duì)垂體FSH 起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，中樞與外周之間形成有效的反饋與負(fù)反饋調(diào)節(jié)，使女性性激素水平始終維持在動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)［12-13］。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：① 補(bǔ)腎疏肝法能夠調(diào)節(jié)POF 大鼠性激素水平。 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組FSH 升高，E2降低，提示POF 大鼠模型建立成功。經(jīng)補(bǔ)腎疏肝法治療后的POF 大鼠血清FSH下降（P＜0.01），E2升高（P＜0.05），說(shuō)明大鼠性激素水平紊亂得到一定改善，提高了卵巢對(duì)激素的敏感性。 ② 補(bǔ)腎疏肝法對(duì)POF 大鼠HPG 軸具有顯著調(diào)節(jié)作用。 POF 大鼠 GnRH 水平升高，GnRH-R 水平降低，排卵功能受到抑制。經(jīng)補(bǔ)腎疏肝法治療后，可明顯降低 POF 大鼠 GnRH 分泌水平（P＜0.01），升高GnRH-R 分泌水平（P＜0.05）。③ 補(bǔ)腎疏肝法能明顯改善POF 大鼠卵巢形態(tài)。 POF 大鼠卵巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，閉鎖卵泡增多，卵泡生長(zhǎng)、成熟停滯。補(bǔ)腎疏肝法能改善卵巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使閉鎖卵泡減少，生長(zhǎng)卵泡增加，同時(shí)促進(jìn)各級(jí)卵泡的成熟。

綜上分析，補(bǔ)腎疏肝法治療POF 大鼠的作用機(jī)制可能與調(diào)控下丘腦-垂體-卵巢軸功能狀態(tài)從而調(diào)節(jié)大鼠性激素水平，糾正內(nèi)分泌紊亂，促進(jìn)卵巢修復(fù)，卵泡生長(zhǎng)、成熟有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳把芯苛搜a(bǔ)腎疏肝法對(duì)POF 大鼠病理形態(tài)和內(nèi)分泌激素水平的影響。 除此之外，本病發(fā)生是否還受其他基因的影響或調(diào)控，則有待進(jìn)一步深入研究。