通冠膠囊對(duì)ISO誘導(dǎo)大鼠心肌缺血的保護(hù)作用*

譚亞芳, 吳嘉妍, 祁建勇, 張敏州△

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科(廣東廣州 510120); 2廣州中醫(yī)藥大學(xué)(廣東廣州 510006)

缺血性心臟病又稱冠狀動(dòng)脈心臟病，是心臟供血不足所引起的疾病。近年來，缺血性心臟病的發(fā)病率逐年上升，已成為危害人類健康和生命的一大類疾病[1-2]。大量實(shí)踐證明，在心肌供血改善后，缺血受損的心肌功能不一定能夠恢復(fù)，可逆性損傷卻可能進(jìn)一步加劇，出現(xiàn)如心律失常、心功能低下、出血性壞死、心臟衰竭加劇等情況[3-4]。如何有效地預(yù)防和減輕缺血損傷亟待解決。從中醫(yī)學(xué)理論上講，缺血性心臟病屬于“胸痹”、心痛”、“厥心病”等范疇，是本虛標(biāo)實(shí)所致，氣虛為本，血瘀為標(biāo)。通冠膠囊是根據(jù)鄧鐵濤教授學(xué)術(shù)思想和六十年的臨證經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)氣虛血瘀這一病機(jī)擬方而成，主要由黃芪、丹參、水蛭和冰片四味藥物組成，四藥合參,藥簡(jiǎn)而力宏,共收益氣活血、祛瘀通脈之功效[5]。臨床研究表明，益氣活血中藥通冠膠囊具有改善冠心病介入治療術(shù)后心肌缺血,改善術(shù)后心室重構(gòu)及心功能,抑制術(shù)后再狹窄以及具有抗凝抗血小板等作用[6-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通冠膠囊后適應(yīng)對(duì)大鼠心肌缺血模型表現(xiàn)出呈劑量依賴性的保護(hù)作用[10]，通冠膠囊能夠改善單個(gè)心肌細(xì)胞的收縮功能，減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷[11]，但具體的保護(hù)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究，本研究起止時(shí)間為2018年1月至2020年3月。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 通冠膠囊主要由黃芪、丹參、水蛭、冰片等組成，由廣東省中醫(yī)院生產(chǎn)(批號(hào):050802)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為體重(230±20)g清潔級(jí)雄性健康SD大鼠。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及飼養(yǎng)方案均遵照中華人民共和國(guó)動(dòng)物處理?xiàng)l例(衛(wèi)生部，中華人民共和國(guó)，條例號(hào)：552001)，并且所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在廣東省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)允許下進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，經(jīng)過嚴(yán)格及合格的檢疫。

1.3 主要試劑及儀器 異丙腎上腺素(ISO)(SIGMA公司)、美托洛爾(SIGMA公司)、PD98059(Cell Signaling Technology公司)、LY294002(Cell Signaling Technology公司)、KN93(Cell Signaling Technology公司)、L-NAME(Cell Signaling Technology公司)。7180全自動(dòng)生化分析儀、Cobas e601電化學(xué)發(fā)光分析儀。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，本實(shí)驗(yàn)采用ISO誘導(dǎo)大鼠急性心肌缺血方法。參考本實(shí)驗(yàn)室既往研究基礎(chǔ)制定手術(shù)方案，分別采用10 mg/kg的ISO皮下注射10 d，85 mg/kg的ISO皮下注射2 d,觀察對(duì)比兩者的造模效果，選用85 mg/kg的ISO皮下注射2 d構(gòu)建量效及機(jī)制實(shí)驗(yàn)中的模型。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法

1.4.2.1 現(xiàn)象實(shí)驗(yàn) 選取8～10周成年雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組(NE組)10只；低劑量模型組(ISO-L組，10 mg/kg)、高劑量模型組(ISO-H組，85 mg/kg)10只；通冠組(TGC組)10只；美托洛爾組(METO組)10只,給藥方法見表1，ISO-L組連續(xù)給藥10 d，其余組連續(xù)給藥2 d。

表1 現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置

1.4.2.2 量效實(shí)驗(yàn) 選取8～10周成年雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為：對(duì)照組(NE組)10只，模型組(ISO組)10只，美托洛爾組(METO組)10只，10 mg TGC組10只，50 mg TGC組10只，100 mg TGC組10只，500 mg TGC組10只，1 000 mg TGC組10只；重復(fù)操作連續(xù)2 d。給藥方法見表2。

表2 量效實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置

1.4.2.3 機(jī)制實(shí)驗(yàn) 選取8～10周成年雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為模型組(ISO組)10只；TGC組[上午按體重皮下注射85 mg/(kg·d)ISO溶液，至少2 h后按體重給予TGC溶液灌胃處理]10只；PD98059組(PD組，上午先按體重腹腔注射1 mg/kg PD98059混懸液，至少0.5 h后按體重皮下注射85 mg/kg ISO溶液，再隔至少2 h按體重給予EC50劑量TGC灌胃處理)10只；LY294002組(LY組)10只；KN93組(KN組)10只；L-NAME組10只。給藥方法如表3所示。

表3 機(jī)制實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.3.1 大鼠血液的心酶五項(xiàng)及肌鈣蛋白(cTnT)指標(biāo) 由廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院檢驗(yàn)科收取樣本，利用AST試劑盒、CK試劑盒、LDH試劑盒、CK-MB試劑盒、HBDH試劑盒、7180全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血液心酶五項(xiàng)的指標(biāo)。利用Troponin T hs STAT試劑盒、Cobas e601電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)血液cTnT的指標(biāo)。

1.4.3.2 解剖大鼠取心、肺、肝、脛骨等組織重量及長(zhǎng)度進(jìn)行比較 解剖大鼠取心、肺、肝等組織，迅速稱量，同時(shí)解剖脛骨，游標(biāo)卡尺讀出長(zhǎng)度。以組織重量與脛骨長(zhǎng)度做出比值。

2 結(jié)果

2.1 現(xiàn)象實(shí)驗(yàn) 各項(xiàng)指標(biāo)均顯示，ISO-L(10 d)或ISO-H(2 d)處理后均較NE組檢測(cè)值高。心酶和cTnT檢測(cè)值顯示，ISO-H組心酶五項(xiàng)和cTnT的檢測(cè)值均較ISO-L組高，本實(shí)驗(yàn)中使用85 mg/kg ISO連續(xù)皮下注射2 d為造模方法。心酶和cTnT檢測(cè)值顯示，TGC組和METO組心酶和cTnT的檢測(cè)值均較ISO組低。心酶和cTnT檢測(cè)值顯示，TGC組和METO組數(shù)據(jù)基本持平。見表4、圖1。

表4 現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)心酶及肌鈣數(shù)據(jù)表

注：與NE組比較 #P<0.01, ##P<0.001; 與ISO-H組比較*P<0.05, **P<0.001

2.2 量效實(shí)驗(yàn) 心酶五項(xiàng)和cTnT檢測(cè)值顯示，TGC給藥后，心酶五項(xiàng)和cTnT的檢測(cè)值均下降。量效曲線顯示，TGC對(duì)大鼠心肌缺血的改善作用隨藥物濃度的增加呈先增加后減小趨勢(shì)，其中最大斜率為3.602，EC50為38.94。心酶五項(xiàng)和cTnT檢測(cè)值顯示，當(dāng)給予10 mg TGC時(shí)，心酶五項(xiàng)和肌鈣數(shù)據(jù)較ISO組下降不大。心酶五項(xiàng)和cTnT檢測(cè)值顯示，當(dāng)TGC劑量達(dá)到1 000 mg/kg時(shí)，心酶五項(xiàng)和cTnT的檢測(cè)值均有所回升。心酶五項(xiàng)和cTnT檢測(cè)值顯示，以一定濃度梯度的TGC給藥后，不同給藥劑量時(shí)心酶五項(xiàng)和cTnT的下降幅度不同，其中100 mg/kg及500 mg/kg時(shí)下降幅度最大。見表5、圖2。

表5 量效實(shí)驗(yàn)心酶及肌鈣數(shù)據(jù)表

注：與ISO組比較 * P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; 與NE組比較 #P<0.01, ##P<0001

2.3 機(jī)制實(shí)驗(yàn) 根據(jù)cTnT柱狀圖可知，PD組和LY組數(shù)據(jù)較ISO組明顯降低且基本與空白對(duì)照組持平。而KN組、L-NAME組數(shù)據(jù)則明顯上升且高于ISO組。心酶五項(xiàng)數(shù)據(jù)圖顯示，ERK通路和eNOS通路對(duì)TGC改善心肌缺血作用有影響且eNOS通路影響較ERK通路大，而AKT和CaMKⅡ通路對(duì)TGC影響較小。解剖學(xué)數(shù)據(jù)顯示，給予TGC的各組數(shù)據(jù)均下降。根據(jù)解剖學(xué)數(shù)據(jù)顯示，給予藥物后肺脛比明顯比肝脛比數(shù)據(jù)下降。解剖學(xué)數(shù)據(jù)顯示，抑制劑組數(shù)據(jù)差別不大。見表6、圖3。

表6 機(jī)制實(shí)驗(yàn)心酶及肌鈣數(shù)據(jù)表

注：與TGC組比較 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)兩種大鼠心肌缺血造模方法，分別是連續(xù)10 d注射10 mg/kg(ISO-L組)和連續(xù)2 d注射85 mg/kg (ISO-H組)。通過測(cè)定心酶和肌鈣數(shù)據(jù)最終確定采用連續(xù)2 d皮下注射85 mg/kg ISO的方法構(gòu)建大鼠急性心肌缺血模型。建立缺血模型后通過TGC藥物干預(yù)，同時(shí)與心肌缺血治療藥物METO作為對(duì)照藥物進(jìn)行對(duì)比。

在現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)中，觀察確定TGC其對(duì)大鼠急性心肌缺血有保護(hù)作用，通過血清學(xué)和解剖學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)均顯示，ISO-L或ISO-H處理后均較NE組檢測(cè)值高，說明ISO可導(dǎo)致大鼠心肌缺血損傷。心酶和cTnT檢測(cè)值顯示，ISO-H組心酶五項(xiàng)和cTnT的檢測(cè)值均較ISO-L組高，說明85 mg/kg ISO連續(xù)皮下注射2 d導(dǎo)致心肌損傷程度更高、心酶和cTnT檢測(cè)值顯示，TGC組和METO組心酶和cTnT的檢測(cè)值均較ISO組低，說明TGC和METO均對(duì)大鼠急性心肌缺血有改善作用。心酶和cTnT檢測(cè)值顯示，TGC組和METO組數(shù)據(jù)基本持平，說明1 g/kg TGC與10 mg/kg美托洛爾改善心肌缺血作用相似。證明了TGC對(duì)大鼠的心肌缺血具改善作用，并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，且其改善心肌缺血作用優(yōu)于METO。

在確定TGC的保護(hù)作用后進(jìn)行量效實(shí)驗(yàn)，通過設(shè)計(jì)5個(gè)濃度藥物梯度，觀察藥物的最有效劑量。在量效實(shí)驗(yàn)中，心酶五項(xiàng)和cTnT檢測(cè)值顯示，TGC給藥后，心酶五項(xiàng)和cTnT的檢測(cè)值均下降，再次證明TGC對(duì)大鼠急性心肌缺血有改善作用。量效曲線顯示，TGC對(duì)大鼠心肌缺血的改善作用隨藥物濃度的增加呈先增加后減小趨勢(shì)，其中最大斜率為3.602，EC50為38.94。心酶五項(xiàng)和cTnT檢測(cè)值顯示，當(dāng)給予10 mg TGC時(shí)，心酶五項(xiàng)和肌鈣數(shù)據(jù)較ISO組下降不大，推測(cè)小劑量TGC對(duì)大鼠心肌缺血損傷的修復(fù)作用不明顯。心酶五項(xiàng)和cTnT檢測(cè)值顯示，當(dāng)TGC劑量達(dá)到1 000 mg/kg時(shí)，心酶五項(xiàng)和cTnT的檢測(cè)值均有所回升，猜測(cè)在TGC治療大鼠急性心肌缺血時(shí)使用過高劑量對(duì)心肌損傷的修復(fù)作用不明顯或開始出現(xiàn)毒性不良反應(yīng)。心酶五項(xiàng)和cTnT檢測(cè)值顯示，以一定濃度梯度的TGC給藥后，不同給藥劑量時(shí)心酶五項(xiàng)和cTnT的下降幅度不同，其中100 mg/kg及500 mg/kg時(shí)下降幅度最大，猜測(cè)當(dāng)給藥劑量于100～500 mg/kg時(shí)TGC改善大鼠急性心肌缺血效果較好。

根據(jù)量效實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的EC50進(jìn)行機(jī)制實(shí)驗(yàn)，以給藥組作對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組則給予EC50濃度的藥物后注射相關(guān)通路的抑制劑，通過解剖學(xué)和血清學(xué)觀察探索其可能的作用機(jī)制。在機(jī)制實(shí)驗(yàn)中，心酶五項(xiàng)和cTnT數(shù)據(jù)充分說明了TGC對(duì)ISO造成的大鼠心肌缺血有明顯改善作用。根據(jù)cTnT柱狀圖可知，PD組和LY組數(shù)據(jù)較ISO組明顯降低且基本與空白對(duì)照組持平，這一結(jié)果說明ERK1/2、AKT通路對(duì)TGC的改善作用影響不大。而KN組、L-NAME組數(shù)據(jù)則明顯上升且高于ISO組，推測(cè)KN和L-NAME對(duì)TGC對(duì)大鼠心肌缺血的改善作用有抑制效果且可能對(duì)心肌缺血有一定損傷作用，其作用可與ISO造成的心肌缺血作用疊加。心酶五項(xiàng)結(jié)果顯示，ERK通路和ENOS通路對(duì)通冠膠囊改善心肌缺血作用有影響且ENOS通路影響較ERK通路大，而AKT和CaMKⅡ通路對(duì)TGC影響較小。推測(cè)TGC對(duì)大鼠心肌缺血的改善作用主要與eNOS通路有關(guān)。解剖學(xué)結(jié)果顯示，給予通冠膠囊的各組數(shù)據(jù)均下降，再次驗(yàn)證了TGC對(duì)大鼠心肌缺血有改善作用。根據(jù)解剖學(xué)數(shù)據(jù)顯示，給予藥物后肺脛比比肝脛比數(shù)據(jù)下降明顯，推測(cè)藥物改善右心缺血優(yōu)于改善左心缺血。解剖學(xué)數(shù)據(jù)顯示，抑制劑組數(shù)據(jù)差別不大，無法通過解剖學(xué)確定TGC對(duì)心肌缺血改善作用的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)用4種通路抑制劑阻斷對(duì)應(yīng)通路，結(jié)果表明，eNOS抑制劑L-NAME處理后肌鈣心酶等指標(biāo)均有明顯上升。本實(shí)驗(yàn)提出通冠膠囊對(duì)大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用的主要通路可能為eNOS通路，ERK1/2和CaMKⅡ通路對(duì)TGC改善作用也有一定影響，但仍需從分子生物學(xué)及基因?qū)W方面進(jìn)一步明確機(jī)制。

此次實(shí)驗(yàn)初步研究了TGC對(duì)心肌缺血改善作用的量效和機(jī)制，但還存在很多不足之處。第一，量效實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的5個(gè)濃度梯度范圍較大，可在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步縮小濃度范圍，更好地探索藥物最有效劑量；第二，關(guān)于改善心肌缺血通路的文獻(xiàn)較少，并沒有過多數(shù)據(jù)支持所設(shè)計(jì)的抑制劑濃度為該抑制劑的最有效給予濃度；第三，由于改善心肌缺血通路的文獻(xiàn)較少，設(shè)計(jì)的通路除eNOS通路外其他通路結(jié)果不太理想，可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行其他探索；第四，此次實(shí)驗(yàn)全部為大鼠藥理實(shí)驗(yàn)，下一步探索可設(shè)計(jì)分子蛋白實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確TGC的作用。