趨化因子CXCR4、CXCL5在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

李 杰 沈雁冰 文秀華

腎實質(zhì)癌是來源于腎小管上皮細(xì)胞的腺癌，85%為透明細(xì)胞癌[1]。腎透明細(xì)胞癌的早期通常無癥狀，或只有發(fā)熱、乏力等全身癥狀，腫瘤體積增大時才被發(fā)現(xiàn)[2]。腎透明細(xì)胞癌在泌尿系統(tǒng)所有的腫瘤中死亡率最高，淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移是臨床上治療效果不佳的主要原因之一[3]。因此對于腎透明細(xì)胞癌的早期發(fā)現(xiàn)和判斷至關(guān)重要。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移多依賴于宿主細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的相互作用，而趨化因子在這種相互作用中起到了重要作用[4]。越來越多的證據(jù)表明，趨化因子參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移過程，其中趨化因子5(CXCL5)在膀胱癌、前列腺癌等惡性腫瘤中出現(xiàn)高表達(dá)，近年來報道證實其直接參與惡性腫瘤進(jìn)展過程，通過增強細(xì)胞增殖和遷移而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。趨化因子受體4(CXCR4)是一種廣泛存在于不同類型細(xì)胞表面上的 G 蛋白偶聯(lián)受體，已被證實是人類惡性腫瘤中最常見的趨化因子受體，在乳腺癌、肺癌、直腸癌中均有表達(dá)。相關(guān)研究表示 CXCR4 在機(jī)體生長、器官和血管形成、紅細(xì)胞生成中均起到了非常重要的作用，并通過激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和效應(yīng)分子，直接參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程[5]。兩者與腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長息息相關(guān)，因此，本研究通過測試趨化因子CXCR4、CXCL5的含量和腎透明細(xì)胞癌的臨床特征的相關(guān)性，探索兩者的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2019年1月在我院腫瘤科進(jìn)行診治的腎透明細(xì)胞癌患者共50例，所有患者均經(jīng)過病理學(xué)檢查證實。男性21例，女性29例；年齡47～63歲，平均年齡為(51.21±4.57)歲；根據(jù)癌細(xì)胞核分級將患者分為4級：Ⅰ級23例，Ⅱ級5例，Ⅲ級17例，Ⅳ級5例；根據(jù)Robson分期法將患者分為Ⅰ期31例，Ⅱ期10例，Ⅲ期5例，Ⅳ期4例。標(biāo)本取自手術(shù)過程中切除的癌組織和癌旁正常組織。本研究方案已經(jīng)通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①診斷均符合2014版腎細(xì)胞癌診斷治療指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，均為首次發(fā)?。虎谛g(shù)前均未行放療、化療等腫瘤特異性治療；③無溶血性疾??；④無原發(fā)性或繼發(fā)性痛風(fēng)、尿毒癥、激素代謝紊亂。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①陳舊性心肌梗死、心力衰竭及其他引起心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)改變的疾??；②外科手術(shù)未能切除腎癌病變；③術(shù)后病理診斷不明確，組織學(xué)分類不清楚；④術(shù)后標(biāo)本保存不完好，沒有足夠的待測組織。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本制作 將手術(shù)過程中切除的腎透明細(xì)胞腫瘤組織和腫瘤旁小于2 cm區(qū)域的正常組織用10%的甲醛固定，并用石蠟進(jìn)行包埋，然后將組織用單片機(jī)行4 μm切片，液氮保存。

1.3.2 HE染色 首先進(jìn)行標(biāo)本脫蠟，用二甲苯和乙醇浸泡半小時后，再放入碳酸鋰飽和溶液中1 min，伊紅溶液中5 min，流水沖洗。滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化酶，避光孵育15 min后，用三羥甲基氨基甲烷洗滌3次，置于95%以上的檸檬酸緩沖液中煮沸40 min。后滴加EnVision+HRP反應(yīng)液，后滴加DAB顯色劑工作液3，3+-二氨基聯(lián)苯胺，光鏡下控制顯色，顯色完全后沖洗，蘇木精復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明后用常規(guī)樹脂封片。

1.3.3 CXCR4與CXCL5陽性判斷 CXCR4與CXCL5指標(biāo)的陽性判斷均采用綜合評分法，根據(jù)染色強度及著色面積對兩者進(jìn)行判斷。首先在染色強度上，將無染色記為0分，淡黃色記為1分、黃色至棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)標(biāo)本陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率，分為≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。將兩者積分相乘，0分陰性，1～4分為弱陽性，5～9為陽性，9分以上為強陽性。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 趨化因子CXCR4、CXCL5在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平比較

癌組織中趨化因子CXCR4、CXCL5的表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表1。

表1 癌組織中及癌旁組織中CXCR4、CXCL5表達(dá)水平比較

2.2 趨化因子CXCR4、CXCL5表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系

趨化因子CXCR4、CXCL5在TNM分期Ⅲ、Ⅳ期的陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期(χ2=6.270、6.131，P=0.012、0.013)，在低分化組織中陽性表達(dá)率顯著高于中、高分化組織(χ2=3.889、6.250，P=0.048、0.012)，在有淋巴轉(zhuǎn)移的患者中陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴轉(zhuǎn)移的患者(χ2=4.955、6.832，P=0.026、0.009)，見表2。

表2 趨化因子CXCR4、CXCL5與患者臨床特征的關(guān)系(例，%)

2.3 趨化因子CXCR4、CXCL5在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

趨化因子CXCR4、CXCL5在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)(=0.467，Kappa=0.740，P=0.001)。見表3。

表3 趨化因子CXCR4、CXCL5與腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)的相關(guān)性/例

3 討論

腎透明細(xì)胞癌約占人類惡性腫瘤總數(shù)的3%，近年來發(fā)病也呈現(xiàn)著越來越高的趨勢，并且有將近50%的患者在被發(fā)現(xiàn)時就是晚期[7-8]。在臨床上，腎透明細(xì)胞癌的診斷主要依據(jù)是病理學(xué)檢測、影像學(xué)檢查，但是也存在一定的局限性[3]。而目前來說，腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生及進(jìn)展機(jī)制還尚不明確，而學(xué)術(shù)界目前普遍認(rèn)為是歸于VHL抑癌基因的突變，造成了基因產(chǎn)物pvhl的缺失，從而使HIF-1A進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而讓一系列缺氧誘導(dǎo)基因上調(diào)[9]，其中CXCR4和CXCL5兩種趨化因子就是其中的重要因素。腫瘤微環(huán)境也是近年來醫(yī)學(xué)界研究的熱點[10]，而 CXCR4和CXCL5在人體內(nèi)通過一系列的信號傳導(dǎo)，直接參與惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，是診斷和治療腎透明細(xì)胞癌的一個重要的切入點。

首先，由本研究的數(shù)據(jù)可知，相對于癌旁組織，癌組織的趨化因子CXCR4、CXCL5表達(dá)水平明顯升高，兩者的表達(dá)水平在腎透明細(xì)胞癌組織表達(dá)中呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)CXCR4基因在眾多癌癥中例如前列腺癌、直腸癌等的組織中均有高表達(dá)，并且表達(dá)量隨病變惡性程度加重而增加，同時，有關(guān)研究表示CXCL5表達(dá)量升高后，腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及血管形成能力顯著增強，有相關(guān)報道表示CXCL5在臨床高分期的惡性黑色素瘤中呈現(xiàn)出極高表達(dá)[11]。本研究的數(shù)據(jù)表示，陽性患者和陰性患者的趨化因子陽性表達(dá)數(shù)值也有極大差異，提示CXCR4和CXCL5的表達(dá)水平和腫瘤的發(fā)展程度也成正相關(guān)。CXCR4和CXCL5作為膜相關(guān)的受體蛋白，在腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)了高表達(dá)，陽性率最高達(dá)到了95.2%，遠(yuǎn)高于癌旁正常組織。CXCR4是高度保守的7個跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)受體[12]，其編碼基因位于染色體2q21，CXCL5 主要由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞外基質(zhì)中合成，在腫瘤細(xì)胞合成和分泌中有重要作用[13]。兩者是細(xì)胞間互相通訊的重要調(diào)控分子，通過復(fù)雜的信號交流網(wǎng)絡(luò)參與腫瘤細(xì)胞的合成生長。作用機(jī)制研究表明CXCR4和CXCL5可激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，如 MAPK、CAMP和蛋白激酶 A等通路，在多種腫瘤的侵襲、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮重要作用。當(dāng)這兩種趨化因子和靶細(xì)胞膜表面受體—7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合時，就會觸發(fā)下游效應(yīng)物的活化和信號肽的級聯(lián)效應(yīng)，從而加快腎透明細(xì)胞癌的惡性發(fā)展[5]。

根據(jù)研究顯示，在不同惡性程度的腫瘤患者中，CXCR4和CXCL5的陽性表達(dá)率表現(xiàn)出了差異，表示兩者在惡性腫瘤的擴(kuò)散和對淋巴轉(zhuǎn)移的影響上起著重要作用。而根據(jù)本研究的實驗數(shù)據(jù)得知，兩者的陽性表達(dá)都和患者的TNM、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有極大的相關(guān)性。淋巴途徑轉(zhuǎn)移在人體許多腫瘤轉(zhuǎn)移中占有重要地位，經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在患者的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中 CXCL5和 CXCR4 的表達(dá)具有正相關(guān)性。血管生成與腫瘤的發(fā)展、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移均關(guān)系密切，新生血管可以為腫瘤的生長提供更多的養(yǎng)分，并且將產(chǎn)生的廢物排出體外。趨化因子就是在血管生成過程中發(fā)揮重要功能的分子[14]。CXCL4是第一個被發(fā)現(xiàn)參與血管生成抑制的分子，CXCR4的活化可以通過一定的信號通路活化 NF-KB，而反過來，活化的NF-KB又可以通過誘導(dǎo)趨化因子的活躍，從而促進(jìn)血管生成，加快腫瘤的生長。據(jù)相關(guān)資料顯示，CXCR4和CXCL5生物軸對于腎透明細(xì)胞癌的患者的血管新生以及腫瘤生長都有促進(jìn)作用，同時可介導(dǎo)免疫及炎癥因子趨化，調(diào)控造血干細(xì)胞遷移和歸巢[15]。根據(jù)張翠薇的動物實驗表示，CXCL5和CXCR4能趨化骨髓來源抑制性細(xì)胞回歸腫瘤，兩者的抗體聯(lián)合PD-1的治療可以增加患者的CD4+和CD8+的浸潤，減輕腫瘤的擴(kuò)散[5，16]。相關(guān)報道顯示，在腎透明細(xì)胞癌組織中，CXCR4 的表達(dá)分布于胞膜及胞漿，腎癌病理分級高分級組的光密度值較低分級組高，差異也較為顯著，表示了CXCR4與癌細(xì)胞的增殖和TNM的分期程度有緊密的聯(lián)系[17]。已有學(xué)者研究證實，利用RNAi 技術(shù)，以 siRNA 抑制 CXCR4 表達(dá)，不僅可抑制癌細(xì)胞在體內(nèi)外的趨化性轉(zhuǎn)移，還可減少體內(nèi)原發(fā)癌的形成，抑制癌細(xì)胞的增殖[18]。因此，對 CXCR4 和CXCL5的活性進(jìn)行抑制，也可減少腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移，這可能是治療腎透明細(xì)胞癌的一個新的研究方向。

綜上所述，CXCR4和CXCL5在腎透明細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且與患者的TNM分期、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系緊密，綜合檢測兩種趨化因子可作為腎透明細(xì)胞癌的重要診斷依據(jù)和判斷預(yù)后效果的生物學(xué)指標(biāo)。