急性非APL白血病患者抗原表達(dá)差異性分析及對療效的影響

仲 華 林志強(qiáng) 王亞南 王志銀 楊曉冬 張青宜 王朝輝

急性白血病(acute leukemia,AL)是1種造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病[1]，主要分為急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性早幼粒細(xì)胞性白血病(acute non promyelocytic leukemia，APL)。AL相關(guān)細(xì)胞系的抗原表達(dá)強(qiáng)弱程度對不同類型疾病診斷、治療方案選擇及病情預(yù)測均具有重要價值[2]。分化的抗原決定簇(cluster of differentiation，CD)在細(xì)胞免疫表型檢測中充當(dāng)鑒定和研究的靶目標(biāo)[3]。CD33分子在一些淋巴系細(xì)胞表面存在異常表達(dá)[4]。CD45可作為篩選白細(xì)胞和非白細(xì)胞的表面標(biāo)志[5-6]。目前對這些CD分子表達(dá)的差異性及其對疾病療效進(jìn)展的預(yù)測價值仍存在爭議，因此本研究選擇158例APL以外的AL患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析，了解其不同分型中異系抗原表達(dá)差異性及對預(yù)后預(yù)測的意義，以期為臨床治療提供參考和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理會討論并批準(zhǔn)后，選擇2017年2月至2019年3月于本院診治的158例APL以外的AL患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，所有患者及家屬均對本研究方案知情并自愿入組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～60歲；②參照相關(guān)共識意見和FAB分型確診為ALL/AML[7-8]；③入院前一個月內(nèi)無激素或免疫抑制類藥物服用史；④自愿受試；⑤接受治療并對治療耐受；⑥臨床資料完整，相關(guān)檢查完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心血管、肝、腎、等重要臟器疾病及精神病者；②有其他血液系統(tǒng)異常者；③腫瘤及感染性疾病者；④標(biāo)本采集不正確或困難；⑤臨床研究過程中出現(xiàn)嚴(yán)重合并癥或并發(fā)癥者需進(jìn)行其他治療；⑥中途失訪。其中ALL 72例，男性38例、女性34例，年齡22歲～58歲、平均(42.58±12.05)歲，L1型35例、L2型18例、L3型9例；AML 86例，男性45例、女性41例，年齡21～60歲、平均(43.02±12.01)歲，M1型14例、M2型19例、M3型39例、M4型14例、M5型8例、M6型8例、M7型0例。

1.2 方法

所有患者入院時均經(jīng)免疫形態(tài)學(xué)診斷確定免疫分型；由臨床醫(yī)師根據(jù)臨床表現(xiàn)、個人特點(diǎn)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查確定治療方案，分別參照《中國成人急性淋巴細(xì)胞白血病診斷與治療專家共識》[7]和《急性髓系白血病治療的專家共識(第二部分)》[8]對ALL和AML患者進(jìn)行治療，ALL以VDP 和VP方案為主，AML以DA和HA方案為主；采用電話及門診檢查相結(jié)合方式進(jìn)行隨訪，患者入院治療時間為生存時間起點(diǎn)，隨訪至患者死于AL相關(guān)事件或納入本研究24個月止，截尾數(shù)據(jù)為失訪、隨訪結(jié)束時死于與AL無關(guān)疾病，記錄158例患者疾病復(fù)發(fā)、緩解例數(shù)及總生存率(overall survival,OS)；隨訪期間無人失訪，能獲取完整臨床資料。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫表型

通過骨髓穿刺術(shù)抽取患者4 ml新鮮骨髓液置于含EDTA抗凝劑的真空采血管中，加入FITC標(biāo)記的單克隆抗體IgG2a,CD10,CD20,CD3,CD7,HLA-DR及PE標(biāo)記的IgG1,CD19,CD5,CD22,CD33,CD13，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107個/ml；分別加入20 μl FITC標(biāo)記的單抗，避光室溫孵育20 min，PBS溶液漂洗單；加入20 μl相應(yīng)PE標(biāo)記的單抗，避光孵育20 min；加入1%多甲聚醛0.5 mL固定,上機(jī)前2 ℃～8 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?；采用Attune NxT流式細(xì)胞儀(賽默飛)檢測，通過cellquest軟件進(jìn)行分析處理獲取相關(guān)抗原CD3,CD5,CD7,CD10,CD13,CD20,CD22,CD33,HLA-DR表達(dá)量，按試劑盒說明，CD3,CD5,CD7,CD10,CD20,CD22,HLA-DR大于20 %為陽性，CD13,CD33大于30%為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用spss 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，針對不同樣本及不同比較模式選擇F檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)、相關(guān)性分析、偏相關(guān)性分析及歸因分析等；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05表示數(shù)據(jù)比較結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組抗原表達(dá)特征分析

72例ALL患者中，CD13陽性率27.78%(20/72)，CD33陽性率22.22%(16/72)；86例AML 患者中T系、B系抗原均有不同程度表達(dá)，其中CD33陽性率33.72%(29/86)最高，其次為CD10陽性率25.58%(22/86)，見表1。將數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，通過F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示ALL患者中CD13、CD33陽性表達(dá)率無顯著差異(P>0.05)；AML患者中CD3、CD10陽性表達(dá)率顯著高于其他抗原陽性表達(dá)率(P<0.05)。

表1 2組抗原表達(dá)情況比較(例，%)

2.2 陽性表達(dá)百分比均值高的CD分子在ALL中表達(dá)結(jié)果

在ALL患者中，CD13和CD33抗原陽性表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 CD13、CD33在ALL中表達(dá)結(jié)果/例

2.3 陽性表達(dá)百分比均值高的CD分子在AML中表達(dá)結(jié)果

分別進(jìn)行兩兩卡方檢驗(yàn)，結(jié)果在AML患者中CD3/CD10和CD3/HLA-DR、CD10/HLA-DR抗原陽性表達(dá)有顯著差異(P<0.05)，CD3/HLA-DR和CD10/HLA-DR抗原表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，見表3～4。

表3 CD3、CD10、HLA-DR在ALL中表達(dá)結(jié)果/例

表4 CD10、HLA-DR在ALL中表達(dá)結(jié)果/例

2.4 化療緩解率與抗原表達(dá)的關(guān)系

72例ALL患者化療后，最終有60例完全緩解，4例部分緩解，8例未緩解；86例AML患者化療后，最終有67例完全緩解，8例部分緩解，11例未緩解。ALL和AML患者中，3～5個療程內(nèi)緩解者有5例為1種以上抗原陽性表達(dá)者，與2個療程內(nèi)緩解者比較有顯著差異(P<0.05)；部分緩解者有2例1種以上抗原陽性表達(dá)者，與2個療程內(nèi)緩解者比較有顯著差異(P<0.05)；未緩解者有5例1種以上抗原陽性表達(dá)者，與2個療程內(nèi)緩解者比較有顯著差異(P<0.05)，見表5。

表5 化療緩解情況與抗原表達(dá)關(guān)系(例，%)

3 討論

隨著環(huán)境污染愈來愈嚴(yán)重，AL發(fā)病率逐年上升[9]。異常增生的原始細(xì)胞通過在骨髓中聚集，抑制人體正常造血功能，可使ALL患者出現(xiàn)貧血、出血、感染甚至組織器官浸潤等表現(xiàn)[10]。AML是指造血系統(tǒng)髓系系列異常增生引起的惡性腫瘤疾病。APL是AML特殊類型，極易發(fā)生出血及血栓形成，死亡率高。細(xì)胞表面的分子標(biāo)志在很大程度上決定了細(xì)胞所發(fā)揮的功能[11]。CD117在造血系統(tǒng)祖細(xì)胞表面呈高表達(dá)水平，且高于常見髓系祖細(xì)胞[12]。關(guān)于APL與抗原陽性表達(dá)特征的分析較多，但對于AML及ALL相關(guān)抗原表達(dá)差異性分析及對療效的影響的報道較少。

本文采用流式細(xì)胞技術(shù)對相關(guān)抗原分子進(jìn)行分析，參考既往研究和試劑盒相關(guān)說明，以CD3,CD5,CD7,CD10,CD20,CD22,HLA-DR大于20 %為陽性，CD13,CD33大于30%為陽性。平均陽性細(xì)胞比例較高的抗原多集中在高表達(dá)范圍，而根據(jù)陽性細(xì)胞比例不同范圍為界進(jìn)一步分析四種CD分子在不同類型AL患者中均有顯著差異[13]。本文結(jié)果顯示，76例ALL患者中，CD13陽性率27.78%，CD33陽性率22.22%，與既往報道基本符合[14]。本文提出的CD13陽性率27.78%略高于馬濤等[15]的研究結(jié)果，主要與該學(xué)者在納入樣本時未考慮相關(guān)患者用藥史有關(guān)。本文86例AML 患者中T系、B 系抗原均有不同程度表達(dá)，其中CD33陽性率33.72%最高，其次為CD10、HLA-DR，遠(yuǎn)高于等指出的12%～24%，而與Mason等[16]的報道較為一致。AML患者中CD3、CD10陽性表達(dá)率顯著高于其他抗原陽性表達(dá)率，與既往提出的AML中淋系的各種標(biāo)記抗原中以CD3 表達(dá)為主符合。Ting等[17]的報道顯示，AML中CD19、CD5呈高表達(dá)水平，本文與該結(jié)果有一定出入，考慮FAB分型中AML有不同分型有關(guān)。既往認(rèn)為在AML各亞型中，M1,M2,M5有較高的CD3表達(dá)，其他分型僅偶見或陰性表達(dá)[18]。且CD3常CD10 共表達(dá)，考慮CD3+ AM多起原于早期髓系造血干/祖細(xì)胞。進(jìn)一步分析抗原表達(dá)強(qiáng)弱與化療敏感性和化療緩解時間相關(guān)性可得，在ALL和AML患者中，經(jīng)3～5個療程內(nèi)緩解者中，其抗原表達(dá)陽性率遠(yuǎn)高于2個療程內(nèi)緩解者，且在部分緩解和未緩解者中，特異性抗原也呈高表達(dá)。臨床上部分緩解與未緩解的病人多系耐藥或難治病人，考慮相關(guān)抗原表達(dá)對療效預(yù)測有重要價值。既往多項(xiàng)報道已表明，在 CD3+ AML中P糖蛋白表達(dá)率顯著高于CD3- AML，且對化療反應(yīng)存在明顯差異。而關(guān)于ALL相關(guān)抗原表達(dá)暫無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本文結(jié)果顯示CD33+ ALL中緩解率高于CD33- ALL，考慮CD33可能參與疾病進(jìn)展。

急性非APL白血病患者抗原表達(dá)差異性對療程緩解率預(yù)測有重要價值，可作為療效判斷的特異性分析。但由于本研究樣本量少、隨訪時間短，相關(guān)抗原的表達(dá)與特異性糖蛋白存在的關(guān)聯(lián)及其對疾病進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制仍需在今后深入研究。