FoxO1蛋白在原發(fā)性肝癌(PHC)組織中的表達(dá)及與對(duì)預(yù)后的影響

吳 蓓 高春輝 陶連元 盧 沛 陳 景

我國作為肝炎大國，原發(fā)性肝癌(PHC)的發(fā)生率一直維持在較高水平，流行病學(xué)研究證實(shí)，我國PHC的發(fā)病率可達(dá)236～472/10萬人左右[1]。臨床上PHC的發(fā)生能夠?qū)е禄颊吒喂δ芩ソ?、多器官功能障礙和病死率的上升[2]。叉頭轉(zhuǎn)錄因子O家族1(FoxO1)是叉頭轉(zhuǎn)錄家族的重要成員，其能夠通過抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性的激活，降低癌細(xì)胞的過度增殖風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而參與到早期惡性腫瘤的發(fā)生過程中[3]。FoxO1還能夠提高癌細(xì)胞的分化成熟能力，降低癌細(xì)胞的異型性。部分研究者探討了FoxO1在其他惡性腫瘤患者中的表達(dá)情況，認(rèn)為FoxO1的表達(dá)缺失與卵巢或者乳腺腫瘤的臨床分期的進(jìn)展或者癌細(xì)胞形態(tài)的改變密切相關(guān)[4-5]，但對(duì)于FoxO1與PHC的關(guān)系研究不足。為了揭示FoxO1的表達(dá)與PHC的發(fā)生關(guān)系，深入揭示PHC的發(fā)病機(jī)制，本次研究選取我院2015年1月至2017年5月收集的90例術(shù)后PHC組織標(biāo)本，探討了FoxO1的表達(dá)及其與PHC患者臨床病理特征的關(guān)系，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2015年1月至2017年5月收集的90例術(shù)后PHC癌組織標(biāo)本為PHC組，癌旁組織標(biāo)本為癌旁組。PHC患者，年齡43～75歲，平均為(54.2±9.6)歲，男性53例，女性37例；病灶直徑：≥5 cm 41例、<5 cm 49例；TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期28例、Ⅲ期32例、Ⅳ期10例；AFP水平：>200 ng/ml 54例、≤200 ng/ml 36例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性肝癌患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范2014年版》中的標(biāo)準(zhǔn)；②患者經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌；③癌旁組為距離腫瘤病灶邊緣5 cm以內(nèi)的肝組織；④研究方案獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意后實(shí)施。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性肝癌；②長期使用免疫抑制劑等藥物；③HIV感染患者；④手術(shù)前具有放化療病史。

1.2 免疫組化染色方法

采用石蠟切片，脫水操作后采用3%H2O2室溫條件下孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，磷酸鹽緩沖液稀釋后的山羊血清封閉抗體5 min，倒去血清后不清洗，加入一抗(購自賽默飛世爾中國 濃度：1∶1000)5 ml，37 ℃孵育2 h，或者放置4 ℃冰箱過夜孵育，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，加入生物素?zé)晒鈽?biāo)記的二抗(購自賽默飛世爾中國 濃度：1∶2000)3 ml，37 ℃孵育20～30 min，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，加入Streptavidin/HRP辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃孵育20～30 min，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒 (PA110)顯色，自來水沖洗，復(fù)染，封片。

1.3 免疫組化染色分析的結(jié)果判定

染色分析的結(jié)果判定：FoxO1蛋白主要分布于細(xì)胞核中，F(xiàn)oxO1蛋白的陽性染色在顯微鏡下均表現(xiàn)為黃色、棕黃色甚至褐色。①FoxO1蛋白在細(xì)胞中的染色程度分為：未染色(0分)、僅僅淡黃色染色(1分)、棕黃色染色(2分)、染色呈褐色、黑色(3分)；②根據(jù)染色的細(xì)胞占比結(jié)果：占比≤10%計(jì)分1分、占比范圍11%～50%計(jì)分2分、占比范圍51%～75%計(jì)分3分、占比>75%計(jì)分4分，染色程度與陽性細(xì)胞計(jì)分之乘積<3分為陰性、≥3分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PHC組與癌旁組中的FoxO1蛋白陽性率比較

PHC組織中FoxO1蛋白陽性表達(dá)率為43.33%，顯著低于癌旁組織的80.00%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組標(biāo)本中FoxO1蛋白陽性率比較(例，%)

2.2 不同病理學(xué)特征PHC組織中FoxO1蛋白陽性率比較

TNM分期(Ⅰ期、Ⅱ期)、單發(fā)病灶、病灶直徑<5 cm的PHC組織中FoxO1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于TNM分期(Ⅲ期、Ⅳ期)、多發(fā)病灶、病灶直徑≥5 cm的PHC組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 不同病理學(xué)特征PHC組織中FoxO1蛋白陽性率比較(例，%)

2.3 FoxO1蛋白陽性與陰性表達(dá)PHC患者3年生存情況比較

FoxO1蛋白陽性表達(dá)PHC患者3年生存率(64.10%)，高于陰性表達(dá)組的37.25%(P<0.05)，見表3。

表3 FoxO1蛋白陽性與陰性表達(dá)的PHC患者3年生存情況比較(例，%)

2.4 多因素分析

采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，結(jié)果顯示：TNM分期增高、發(fā)生脈管癌栓、肝硬化、FoxO1蛋白表達(dá)下調(diào)是PHC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表4 多因素分析結(jié)果

3 討論

PHC是較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其短期內(nèi)病情進(jìn)展速度較快，遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高。在長期乙肝病毒感染或者致癌因子接觸的條件下，小葉上皮細(xì)胞的異常分裂過程，能夠顯著增加PHC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[6]。臨床上PHC患者的中位生存時(shí)間或者五年生存率等生存預(yù)后指標(biāo)較差，其中位生存時(shí)間不足34個(gè)月，五年生存率不足40%[7-8]。不同的臨床病理因素均能夠影響到PHC的病情進(jìn)展，而通過對(duì)于不同臨床影響因素的分析，不僅能夠揭示PHC的部分發(fā)病病因，同時(shí)還能夠在PHC患者出院后隨訪方面發(fā)揮作用。

FoxO1蛋白能夠調(diào)控癌細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控依賴性蛋白激活的轉(zhuǎn)錄及翻譯，增加G0/S期比例，穩(wěn)定癌細(xì)胞周期[9]。分子機(jī)制方面的研究顯示，F(xiàn)oxO1蛋白表達(dá)濃度的改變在促進(jìn)癌細(xì)胞分化成熟、降低癌細(xì)胞的粘附能力等方面同樣發(fā)揮了重要的作用[10]。部分研究者已經(jīng)探討了FoxO1蛋白在肝癌患者中的表達(dá)情況，認(rèn)為FoxO1蛋白的表達(dá)缺失與肝癌的早期發(fā)生密切相關(guān)[11]。

FoxO1蛋白在病例組患者中的表達(dá)明顯下降，表明FoxO1蛋白的表達(dá)缺失可能影響到了PHC的早期發(fā)生過程。下列因素可能影響到了相關(guān)機(jī)制的發(fā)生和進(jìn)展[12-14]：①FoxO1蛋白的表達(dá)缺失導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖調(diào)控異常，癌細(xì)胞的持續(xù)性自我增殖能力持續(xù)上升；②FoxO1蛋白的表達(dá)缺失可導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲能力明顯改變，上皮細(xì)胞突破基底膜的風(fēng)險(xiǎn)明顯的增強(qiáng)。陳俊任等[15]研究者也在探討PHC的發(fā)病機(jī)制過程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1蛋白在PHC患者中的表達(dá)陽性率可平均下降35%以上，特別是在中晚期惡性腫瘤或者遠(yuǎn)期病死率較高的患者中，F(xiàn)oxO1蛋白的表達(dá)濃度可進(jìn)一步的下降。對(duì)于FoxO1蛋白的表達(dá)與PHC的關(guān)系研究可見，在臨床分期較早、單發(fā)病灶或者腫瘤直徑較小的PHC患者中，F(xiàn)oxO1蛋白的表達(dá)陽性率可顯著的上升，提示了FoxO1蛋白的表達(dá)對(duì)于PHC患者臨床分期等病理特征的影響，這主要由于FoxO1蛋白的表達(dá)缺失能夠提高癌細(xì)胞對(duì)于臨近正常肝臟上皮組織的侵襲能力，導(dǎo)致癌細(xì)胞癌栓深度和癌栓范圍的增加，提高了PHC的臨床分期；而FoxO1蛋白的表達(dá)缺失對(duì)于腫瘤直徑等的影響，考慮與肝臟上皮細(xì)胞增殖特性的改變有關(guān)。但本次研究中，并未發(fā)現(xiàn)FoxO1蛋白的表達(dá)與PHC患者脈管癌栓或者甲胎蛋白(AFP)的關(guān)系，考慮可能與本次研究的樣本量限制有關(guān)。FoxO1蛋白陽性表達(dá)率PHC患者3年生存率64.10%高于陰性表達(dá)組的37.25%，提示了FoxO1蛋白的表達(dá)與PHC患者臨床預(yù)后的關(guān)系，這主要由于FoxO1蛋白的表達(dá)陽性率的維持，能夠穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，降低腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，最終影響到臨床預(yù)后。最后本次研究發(fā)現(xiàn)，TNM分期增高、發(fā)生脈管癌栓、肝硬化、FoxO1蛋白表達(dá)下調(diào)是PHC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示臨床上對(duì)于具有相關(guān)高危臨床特征表現(xiàn)的患者，應(yīng)注意對(duì)于患者的隨訪，采用綜合性的治療措施，從而改善PHC的臨床結(jié)局。

綜上所述，在PHC患者中，F(xiàn)oxO1蛋白的表達(dá)明顯的下降，同時(shí)FoxO1蛋白的表達(dá)缺失與PHC患者的臨床病理特征和臨床預(yù)后密切相關(guān)。