齊墩果酸衍生物的合成及其抗癌活性的研究

張蓬勃，宋艷玲

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

齊墩果酸的立體結(jié)構(gòu)十分獨(dú)特，是一類生物活性多樣化的天然產(chǎn)物，具有保肝、抗炎、降血糖、降血脂和抗病毒[1-4]等作用，特別是其具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性[5]，由于其對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性的毒性作用而對(duì)正常細(xì)胞并無不良影響的特性，使此類化合物成為國(guó)內(nèi)外抗腫瘤藥物重點(diǎn)研究的對(duì)象之一.齊墩果酸對(duì)非小細(xì)胞癌、黑色素瘤及卵巢癌等均表現(xiàn)出一定的抑制能力[6]；另外，齊墩果酸還可抑制K562白血病細(xì)胞株的生長(zhǎng)，并促使細(xì)胞凋亡[7]；對(duì)肺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)齊墩果酸可介導(dǎo)其細(xì)胞的凋亡進(jìn)程.總之，針對(duì)齊墩果酸抗腫瘤活性的研究表明齊墩果酸可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及凋亡，其作用機(jī)理貫穿了腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段[8].

Chen等[9]將苯磺酰基呋喃氧化物、苯基呋喃氧化物與琥珀酸基經(jīng)反應(yīng)偶聯(lián)到齊墩果酸的C-3位羥基，合成了一系列齊墩果酸雜合呋喃唑酮衍生物.研究發(fā)現(xiàn)，此類化合物能控制一氧化氮的合成與釋放，是一種潛在的肝癌治療藥物，化合物濃度為1 μmol/L時(shí)，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率為100 %，為活性最佳的化合物.蘇春華等[10]先將乙酰氧基連入齊墩果酸的C-3位，再將C-28位羧基與α-氨基磷酸酯通過酰胺鍵引入到C-3位的乙酰氧基上，合成了一類齊墩果酸α-氨基磷酸酯衍生物.其體外抗腫瘤活性顯示，對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率超過了78 %.查閱已發(fā)表的文獻(xiàn)，對(duì)齊墩果酸的結(jié)構(gòu)改造多為C-3位和C-28位，本文對(duì)齊墩果酸A環(huán)進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)，從而設(shè)計(jì)一系列新型化合物，以期提高目標(biāo)化合物的生物活性和生物利用度.擴(kuò)展了齊墩果烷型五環(huán)三萜的結(jié)構(gòu)多樣性，這對(duì)于OA的進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-600型核磁共振儀，美國(guó)Bruker公司；Büchi B-540熔點(diǎn)測(cè)定儀，瑞士Büchi公司；薄層色譜(GF-254)、柱色譜硅膠(200～300目)，青島海洋化工有限公司；齊墩果酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98 %)，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；芳香胺類藥品，上海麥克林生化科技有限公司.其他溶劑和藥品均為分析純.

1.2 合成實(shí)驗(yàn)

齊墩果酸衍生物合成路線圖1所示.

反應(yīng)試劑和條件:(a) 瓊斯試劑,丙酮,異丙醇,0 ℃; (b) 甲酸乙酯,甲苯,甲醇鈉,25 ℃; (c) 甲醇鈉,質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 %的過氧化氫,甲醇,室溫; (d) 芳香酰氯,二氯甲烷,40 ℃; (e) 芳香胺,4-二甲氨基吡啶,吡啶,室溫.

1.2.1 3-羰基-齊墩果酸(1)的制備

將齊墩果酸(4.40 g，9.35 mmol)溶于100 mL丙酮中，冰浴下緩慢滴加瓊斯試劑(11.5 mL)，直至反應(yīng)液橘紅色不再消失，滴畢，室溫下反應(yīng)1～2 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)完畢，加入130 mL異丙醇淬滅.反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸除部分溶劑，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌，水洗，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，得淡黃綠色固體，干燥，甲醇重結(jié)晶得白色晶體化合物3-羰基-齊墩果酸4.15 g，產(chǎn)率95 %，mp 186～187 ℃(文獻(xiàn)mp 185～186 ℃)[9].

1.2.2 2-羥基亞甲基-3-羰基-齊墩果酸(2)的制備

將3-羰基-齊墩果酸(4.15 g，8.87 mmol)溶于50 mL無水甲苯中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)97 %甲酸乙酯(2.0 mL)、甲醇鈉(3.76 g，69.54 mmol)25 ℃下反應(yīng)3 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后加入適量二氯甲烷稀釋，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %鹽酸洗滌3次，飽和NaCl溶液洗滌，水洗，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物2-羥基亞甲基-3-羰基-齊墩果酸3.73 g，產(chǎn)率89.8 %，mp 210～214 ℃(文獻(xiàn)mp 211-212 ℃)[9].

1.2.3 2,3-甲酯基-齊墩果酸(3)的制備

將2-羥基亞甲基-3-羰基-齊墩果酸(2 g，4.14 mmol)溶于100 mL甲醇中，加入甲醇鈉(2.24 g，41.40 mmol)，冰浴條件下滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 %的H2O2(10 mL)，0.5 h后撤冰，室溫下反應(yīng)3 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后二氯甲烷萃取，蒸餾水洗滌，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物2,3-甲酯基-齊墩果酸1.32 g，產(chǎn)率66 %，mp 221.3～223.7 ℃.

1.2.4 2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯(4)的制備

將2,3-甲酯基-齊墩果酸(1 g，1.89 mmol)溶于20 mL干燥二氯甲烷溶液中，冰浴條件下緩慢滴加草酰氯(1.19 g，9.43 mmol)，0.5 h后撤冰，40 ℃下反應(yīng)2h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后蒸發(fā)有機(jī)溶劑，干燥環(huán)己烷沖洗3次，蒸發(fā)得白色固體化合物2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯0.98 g，產(chǎn)率98 %.

1.2.5 化合物Ⅰ1-Ⅰ4的制備

1.2.5.1 化合物Ⅰ1的制備

將2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯(0.15 g，0.274 mmol)溶于10 mL無水二氯甲烷中，緩慢滴入溶于10 mL苯胺(0.128 g，1.37 mmol)的二氯甲烷溶液，加入干燥吡啶(0.5 mL)，4-二甲氨基吡啶(0.001 4 g，0.04 mmol)25～30 ℃條件下反應(yīng)12 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后二氯甲烷萃取，蒸餾水洗滌，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，硅膠柱色譜分離,甲醇/二氯甲烷洗脫,得白色固體化合物Ⅰ10.083 g，產(chǎn)率55.3 %，mp 181～184 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13)，δ：7.88～7.83(2H,m,ph-H-2,H-6),7.51(1H,t,J=7.1 Hz,ph-H-4),7.16～7.07(2H,m,ph-H-3,H-5),6.48(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.40(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.56(3H,s,3-COOCH3),1.20(6H,s,H-23、H-24),1.00(3H,s,H-25),0.96(3H,s,H-26),0.94(3H,s,H-29),0.93(3H,s,H-27),0.91(3H,s,H-30).

1.2.5.2 化合物Ⅰ2的制備

實(shí)驗(yàn)步驟同化合物Ⅰ1.2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯(0.15 g，0.274 mmol)與對(duì)甲基苯胺(0.148 g，1.37 mmol)反應(yīng)，得白色固體化合物 Ⅰ20.079 g，產(chǎn)率52.6 %，mp 185～188 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13),δ：7.57～7.52(2H,m,ph-H-2,H-6),7.15～7.07(2H,m,ph-H-3,H-5)，6.50(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.38(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.56(3H,s,3-COOCH3),2.33(3H,d,J=9.2 Hz,ph-CH3)，1.21(6H,s,H-23、H-24),1.01(3H,s,H-25),0.96(3H,s,H-26),0.94(3H,s,H-29),0.93(3H,s,H-27),0.89(3H,s,H-30).

1.2.5.3 化合物Ⅰ3的制備

實(shí)驗(yàn)步驟同化合物Ⅰ1.2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯(0.15 g，0.274 mmol)與對(duì)氯苯胺(0.175 g，1.37 mmol)反應(yīng)，得白色固體化合物 Ⅰ30.073 g，產(chǎn)率48.6 %，mp 184～185 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13)，δ：7.99(2H,d,J=8.8 Hz,ph-H-2,H-6),7.65(2H,d,J=8.7 Hz,ph-H-3,H-5),6.51(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.40(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.53(3H,s,3-COOCH3),1.20(6H,s,H-23、H-24),1.08(3H,s,H-25),0.89(3H,s,H-26),0.86(3H,s,H-29),0.82(3H,s,H-27),0.79(3H,s,H-30).

1.2.5.4 化合物Ⅰ4的制備

實(shí)驗(yàn)步驟同化合物Ⅰ1.2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯(0.15 g，0.274 mmol)與鄰甲氧基苯胺(0.169 g，1.37 mmol)反應(yīng)，得白色固體化合物 Ⅰ40.066 g，產(chǎn)率44 %，mp 187～188 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13)，δ：8.01(1H,t,J=7.2 Hz,ph-H-3),7.88～7.83(2H,m,ph-H-4,H-6),7.40(1H,t,J=7.1 Hz,ph-H-5),6.51(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.40(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.53(3H,s,3-COOCH3),2.54(3H,s,ph-OCH3)，1.20(6H,s,H-23、H-24),1.04(3H,s,H-25),0.93(3H,s,H-26),0.89(3H,s,H-29),0.83(3H,s,H-27),0.80(3H,s,H-30).

2 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

選取舒尼替尼為陽性對(duì)照藥，舒尼替尼結(jié)構(gòu)中含有脲基活性片段，其抑制活性具有參考意義.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌細(xì)胞(A549)和人胃癌細(xì)胞(SGC7901)以每孔5×103個(gè)接種于96孔板內(nèi)，每組3個(gè)復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后備用.待細(xì)胞貼壁后,分別加入待測(cè)化合物(Ⅰ1～Ⅰ4)、OA和舒尼替尼，藥品濃度為10 μmol/L，空白組為陰性對(duì)照組，舒尼替尼為陽性對(duì)照組.培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h.加入MTT溶液(5 g/L，20 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去每孔上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，震蕩器上震蕩5 min，然后用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)OD值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值，計(jì)算各組細(xì)胞的IC50.

抑制率=(對(duì)照組OD值-藥物組OD值)/對(duì)照組OD值×100 %.

化合物抗腫瘤活性和抑制率見表1.由表1數(shù)據(jù)可以看出：化合物Ⅰ4對(duì)A549、SGC7901細(xì)胞具有良好的抑制作用，優(yōu)于陽性對(duì)照藥舒尼替尼(13.3 μmol·L-1)；苯環(huán)上取代官能團(tuán)的改變，其抑制率具有差別；鄰位的甲氧基團(tuán)活性最好，氯原子活性稍差(21.8 μmol·L-1)，對(duì)位甲基活性差(26.1 μmol·L-1)，無取代基苯環(huán)活性最低(35.3 μmol·L-1).設(shè)計(jì)合成的4個(gè)化合物均優(yōu)于原料OA.

表1 化合物對(duì)A549和SGC7901細(xì)胞株的抗腫瘤活性Table 1 Anti-tumor activity of the target compounds on A549 and SGC7901 cell lines

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)并合成了4個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的OA衍生物(Ⅰ1～Ⅰ4)，活性實(shí)驗(yàn)表明除化合物Ⅰ1外，其他化合物對(duì)A549和SGC7901細(xì)胞均有明顯的抑制作用.尤其是化合物Ⅰ4對(duì)A549細(xì)胞具有良好的抑制作用，優(yōu)于陽性對(duì)照藥舒尼替尼.該類化合物構(gòu)效關(guān)系正在進(jìn)一步研究，該研究結(jié)果對(duì)齊墩果酸衍生物的進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)具有一定的指導(dǎo)意義.