APOE基因多態(tài)性和晚期糖基化終產(chǎn)物與老年冠心病的相關(guān)性分析

曹雅茹，陳秀梅，王向明，查志敏，劉 歡，郭 妍

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心血管科，江蘇 南京 210029

隨著我國人口老齡化的進(jìn)展，冠心病嚴(yán)重危害老年人的生活和健康，是導(dǎo)致死亡的主要原因。明確冠心病危險因素對進(jìn)行一級和二級預(yù)防至關(guān)重要。除了吸煙、高血壓、高脂血癥、糖尿病等傳統(tǒng)危險因素外，目前研究表明載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）ε4 等位基因［1］和晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end product，AGE）水平增加［2］也是冠心病的重要危險因素。

APOE 是主要的膽固醇載體，在維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用［3］，APOEε4能增加血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的水平，也能增加機(jī)體慢性炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的敏感性，與冠心病發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系。羧甲基賴氨酸（carboxy methyl lysine，CML）是體內(nèi)最豐富的AGE 類型，在許多研究中通常用做糖基化標(biāo)志。AGE 與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）結(jié)合在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，通過激活多種信號通路，損傷血管內(nèi)皮和血管內(nèi)通透性，進(jìn)一步影響脂質(zhì)代謝，從而引發(fā)心血管粥樣硬化［4］。可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（soluble receptor for advanced glycation end products，sRAGE）具有結(jié)合AGE的能力而不激活下游信號通路，可以阻止全長RAGE的激活并減輕炎癥損傷［5-6］。

在老年人群中，APOE 基因多態(tài)性及AGE 水平對冠心病有多大的危險性以及兩者是否互相影響目前尚不清楚，因此本研究對老年冠心病患者APOE基因多態(tài)性與AGE相關(guān)危險因素進(jìn)行了分析。

1 對象和方法

1.1 對象

入選2019 年1—12 月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心血管科住院的患者90 例（年齡≥60歲），分為冠心病組46 例和對照組（非冠心病）44例。根據(jù)冠狀動脈CT 血管造影（computed tomography angiography，CTA）在冠狀動脈狹窄評估中的應(yīng)用價值［7］及我國2018年《穩(wěn)定性冠心病診斷與治療指南》［8］，冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)冠脈造影檢查證實(shí)至少有1 支冠狀動脈血管狹窄≥50%或冠脈CTA 檢查證實(shí)至少有1支冠脈管腔狹窄≥50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：所有入選病例均排除心肌病、免疫系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、合并嚴(yán)重感染。

1.2 方法

1.2.1 收集一般資料

收集所有入選患者的臨床資料，包括年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、血壓、心率、高血壓病史、糖尿病病史等，于空腹8 h后次日早晨采集外周靜脈血，在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生化室進(jìn)行常規(guī)生化指標(biāo)檢測。

1.2.2 APOE基因分型檢測

APOE基因分型檢測南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心基因診斷室進(jìn)行檢測?；蛐酒蓹z測出6 種APOE 基因型，即ε2/2、ε2/3、ε3/3、ε2/4、ε3/4、ε4/4。

1.2.3 血漿CML、sRAGE的檢測

所有患者于入院次日清晨空腹采集外周靜脈血，4 ℃離心3 000 r/min 10 min，分離血漿后放置于-80 ℃冰箱中保存，CML 和sRAGE 測定采用ELISA 法，試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）表示，比較采用卡方檢驗(yàn)。計量數(shù)據(jù)均行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)資料的兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；非正態(tài)資料的兩組比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行非參數(shù)統(tǒng)計，以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示。冠心病危險因素應(yīng)用二元Logistic 回歸方法進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本臨床特征

冠心病組與對照組的基本臨床特征見表1。冠心病組46例，其中男33例，女13例，中位年齡73.0歲；對照組44 例，其中男30 例，女14 例，中位年齡78.5歲。冠心病組高血壓人數(shù)及服用他汀類藥物的比例高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。年齡、性別比例、吸煙史、血脂、空腹血糖、肌酐等指標(biāo)，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 臨床基本資料Table 1 Basic clinical datas

2.2 APOE基因型及等位基因頻率比較與分析

表2 表明APOE 基因型頻率符合Hardy-Wenberg（H-W）遺傳平衡，具有群體代表性。冠心病組和對照組基因型總體分布存在差異（P＜0.05），兩組ε3/3基因型分布均最多，冠心病組ε3/4基因型、ε4/4基因型分布較對照組增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；冠心病組ε2/3 基因型分布較對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；冠心病組APOEε2、APOEε3 和APOEε4 等位基因頻率分別為4.3%、79.4%和16.3%，冠心病組APOEε2等位基因頻率明顯低于對照組，APOEε4等位基因頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

表2 90例患者APOE基因型的H-W檢驗(yàn)Table 2 H-W test of APOE genotype in 90 patients

表3 兩組患者APOE基因頻率比較Table 3 Comparison of APOE gene frequency between the two groups ［n（%）］

2.3 血漿CML、sRAGE的表達(dá)

分析APOEε4 攜帶者和非攜帶者血漿CML、sRAGE的水平，APOEε4攜帶者的CML、sRAGE水平高于非攜帶者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表4）。冠心病組與對照組血漿CML、sRAGE水平的分析中，冠心病組患者CML、sRAGE 水平均高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表5）。

表4 血漿CML、sRAGE與APOEε4攜帶者的關(guān)系Table 4 Plasma CML，sRAGE and carriers of APOEε4 ［μg/L，M（P25，P75）］

表5 冠心病組與對照組CML、sRAGE水平Table 5 CML and sRAGE levels in the CHD group and the control group ［μg/L，M（P25，P75）］

2.4 冠心病危險因素分析

應(yīng)用二元Logistic 回歸分析方法進(jìn)行單因素分析顯示，APOEε4攜帶者與冠心病存在顯著相關(guān)性，APOEε4 攜帶者患冠心病的風(fēng)險是非攜帶者的3.511 倍（95%CI：1.121～10.994，P=0.031），而CML、sRAGE水平與冠心病之間無顯著相關(guān)性（表6）。

3 討論

APOE是位于19號染色體長臂上的APOE基因編碼的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受體配體。APOE 具有多態(tài)性，存在3 種等位基因，分別編碼ε2、ε3、ε4，形成6種基因型，即ε2/2、ε2/3、ε 3/3、ε2/4、ε3/4、ε4/4［9］，其中APOEε4攜帶者包括3種基因型：ε2/4、ε3/4、ε4/4。在APOE 的3 個等位基因中ε3最常見，在普通人群中的頻率為78%，其次是ε4和ε2，頻率分別約為15%和7%［10］。APOE 的3種異構(gòu)體與受體的親和力不同而影響脂質(zhì)代謝，從而不同程度地影響血脂水平和動脈粥樣硬化病變的形成［11］。APOE 的氨基末端負(fù)責(zé)與LDL 受體結(jié)合，羧基末端負(fù)責(zé)介導(dǎo)APOE 與表面脂蛋白的結(jié)合。APOEε4選擇性地與富含甘油三酯的脂蛋白如極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）結(jié)合，與VLDL-APOEε3 顆粒相比，VLDL-APOEε4 顆粒從血漿中去除的速度更快，導(dǎo)致LDL 受體下調(diào)，從而增加循環(huán)中LDL的濃度［12-13］。LDL的主要功能是運(yùn)輸膽固醇到肝臟以外的組織，可以使血中膽固醇升高，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生。與既往研究結(jié)果一致［14］，本研究發(fā)現(xiàn)老年冠心病患者APOEε4等位基因頻率顯著高于對照組，盡管ε4等位基因頻率較ε3低，但APOEε4等位基因是老年冠心病患者的獨(dú)立危險因素。

AGE是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子在非酶促條件下，與葡萄糖或其他還原單糖反應(yīng)生成的不可逆產(chǎn)物，已知循環(huán)中存在不同的AGE，包括CML、羧乙基賴氨酸（carboxy ethyl lysine，CEL）、氫咪唑酮（hydroimidazolone，MG-H1）等［15］。sRAGE 是RAGE的可溶形式，能夠在循環(huán)中檢測到，它是通過金屬蛋白酶或選擇性剪接使RAGE從細(xì)胞表面脫落而產(chǎn)生的［16-17］。sRAGE 作為惰性的RAGE 誘餌受體，結(jié)合RAGE 配體而不激活下游信號通路［18］，從而減弱氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)老年冠心病組患者血漿CML、sRAGE水平均高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。冠心病患者sRAGE升高可能是活化的白細(xì)胞為對抗過度炎癥激活而釋放的結(jié)果。

Deo 等［19］在172 例健康人中進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)APOEε4攜帶者的糖基化生物標(biāo)志物（包括乙二醛、熒光AGE和CML）和sRAGE含量較APOEε4非攜帶者高，提示APOEε4 攜帶者AGE 水平增加可能是導(dǎo)致冠心病風(fēng)險增加的原因之一。APOEε4攜帶者及AGE水平增加都可以通過影響脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化病變，所以本研究繼續(xù)探討兩者在冠心病發(fā)病風(fēng)險增加中有無相互影響，本研究得到APOEε4 攜帶者的血漿CML、sRAGE水平高于APOEε4 非攜帶者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。冠心病組APOEε4 攜帶者的血漿CML、sRAGE 水平較對照組APOEε4 攜帶者高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明APOEε4攜帶者及AGE水平增加在冠心病發(fā)病風(fēng)險中無明顯相互影響。

控制可改變的危險因素可以顯著降低冠心病的發(fā)病率［20］。AGE 的來源包括內(nèi)源性生成及外源性攝入，在衰老過程中，由于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率降低，AGE 在組織中積累［2］。少量的AGE 產(chǎn)生是正常代謝的結(jié)果，但在慢性疾病的背景下，AGE產(chǎn)生增加，內(nèi)源性AGE 形成在AGE 總負(fù)荷中只占很小的一部分，飲食是AGE 最重要的外源性來源之一，取決于營養(yǎng)成分和所采用的食品加工方法［21］。因此減少AGE 攝入可能通過控制可改變的危險因素降低冠心病的發(fā)病率。本研究未發(fā)現(xiàn)CML 水平與老年人冠心病之間存在顯著相關(guān)性，可能與患者的飲食習(xí)慣不同有關(guān)。由于CML 水平并不總是與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)［2］，同時考慮到本研究納入的樣本量較少，具有一定局限性，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究血漿CML水平與老年人冠心病之間的相關(guān)性。

綜上所述，隨著年齡增長，APOEε4等位基因仍然是老年冠心病患者的獨(dú)立危險因素，而AGE水平與老年人冠心病之間無顯著相關(guān)性。