擬無(wú)枝酸菌屬羽毛降解菌株BJA-103的誘變育種

嚴(yán) 冬，李姜函，陳 歡，趙康康，顏 華，賈良輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

在牲畜生產(chǎn)和肉類加工中會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)廢物和副產(chǎn)物，包括骨頭、皮膚及富含角蛋白的爪蹄、羽毛等[1]。每年在畜牧業(yè)中產(chǎn)生的雞羽毛副產(chǎn)物就達(dá)50億kg[2]。研究表明，羽毛成分與動(dòng)物纖維相似，其最主要的結(jié)構(gòu)蛋白是角蛋白[3]，可用作塑料、制藥等領(lǐng)域的珍貴原料[4-5]。在角蛋白的結(jié)構(gòu)中，包含大量α-螺旋及β-折疊。豐富的二硫鍵含量使得角蛋白具有極強(qiáng)的水不溶性與耐受性[6]。因此，目前對(duì)羽毛的主要處理方法是焚燒法，而這會(huì)使得有機(jī)副產(chǎn)物在焚燒過(guò)程中產(chǎn)生多種污染物，包括固體顆粒、酸性氣體、氮氧化物，對(duì)環(huán)境造成極大危害[7]。此外，部分羽毛會(huì)采用工業(yè)方法進(jìn)行降解處理，但由于降解處理時(shí)常使用大量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及強(qiáng)氧化劑，這不僅會(huì)破壞羽毛降解得到的產(chǎn)物，還會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染[8-9]，同時(shí)也會(huì)消耗大量的淡水資源，加劇水資源缺乏[10]。因此，環(huán)境友好型生物降解羽毛逐漸走進(jìn)了人們的視野[11]。

目前，已分離出多種能發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的微生物，包括細(xì)菌[12]、放線菌[13-14]、真菌[15]等，并且已有角蛋白酶異源表達(dá)的報(bào)道[16]。然而，研究表明在角蛋白降解過(guò)程中至少有3種不同的酶參與，分別發(fā)揮內(nèi)切、外切及寡肽水解作用[17]；角蛋白酶在降解羽毛過(guò)程中表現(xiàn)低效[18]。因此，在單個(gè)基因水平上操作，以期獲得高效降解羽毛的菌株往往會(huì)受到阻礙[19]?；蛘T變是一種基因組水平上的操作，DNA在誘變劑作用下被損傷，而在DNA修復(fù)過(guò)程中，細(xì)微的偏差會(huì)改變細(xì)胞的代謝[20-21]。應(yīng)用基因誘變方法可以忽視并克服單個(gè)基因水平操作時(shí)受到的阻礙，從而選育出羽毛降解速率快、最終降解率高的理想表現(xiàn)型菌株。為此，本研究通過(guò)對(duì)具有羽毛降解能力的BJA-103菌株進(jìn)行基因誘變，篩選獲得羽毛降解速率更快、降解程度更高的突變株，并對(duì)突變株產(chǎn)生的角蛋白酶進(jìn)行初步酶學(xué)探究，為其進(jìn)一步擴(kuò)大發(fā)酵及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

擬無(wú)枝酸菌屬羽毛降解菌株BJA-103來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)放線菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。前期研究已獲得該菌株的全基因組信息[22]。羽毛來(lái)自本地市場(chǎng)的雞毛廢料，用去污粉清洗后多次用蒸餾水涮洗，自然風(fēng)干至恒質(zhì)量。角蛋白來(lái)自陜西寶禾生物科技有限公司(生產(chǎn)批次BBSW200414-1,直徑≤180 μm)。

高氏一號(hào)培養(yǎng)基(1 000 mL)：淀粉20.0 g，KNO31.0 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.001 g，瓊脂18.0 g，pH 7.2。

TSB培養(yǎng)基(1 000 mL)：胰蛋白胨17.0 g，葡萄糖2.5 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO42.5 g，pH 7.2。

解除氮代謝分解調(diào)節(jié)篩選培養(yǎng)基：在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加入色氨酸，使其質(zhì)量濃度達(dá)到1.5 mg/mL。

羽毛降解培養(yǎng)基(1 000 mL)：羽毛粉10.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，K2HPO41.0 g，胰蛋白胨1.7 g，葡萄糖0.25 g，大豆蛋白胨0.3 g，pH 7.2。

牛奶培養(yǎng)基(200 mL)：稱取4.0 g瓊脂加入100 mL H2O，121 ℃滅菌25 min；稱取1.0 g脫脂奶粉加入100 mL H2O，115 ℃滅菌20 min?；旌鲜褂谩?/p>

1.2 硫酸二乙酯(DES)誘變

1.2.1 菌株活化與菌懸液制備 將BJA-103菌株涂布在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上活化。每次取固定面積菌落，接種到TSB搖瓶培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)28 h至有明顯菌絲體產(chǎn)生，即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。加入已滅菌玻璃珠20粒，28 ℃、180 r/min振蕩破碎菌絲體1 h。振蕩結(jié)束后，使用已滅菌玻璃注射器(含脫脂棉)過(guò)濾，除去未完全破碎菌絲體，得到菌液。離心后，使用0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH 7.0)洗滌2次，再加入適量PBS重懸浮得到菌懸液。

1.2.2 DES致死率曲線制作 取菌懸液1 mL，加入25% Na2S2O3溶液0.5 mL，作為處理0 min對(duì)照組。剩余菌懸液中加入DES使其終濃度為1%，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)第15，30，45，60，80 min時(shí)取樣1 mL，立即加入25% Na2S2O3溶液0.5 mL終止誘變。離心后，菌泥加入1 mL 0.1 mol/L PBS (pH 7.0)重懸浮。

稀釋重懸后菌泥至10-4CFU/mL，涂布高氏一號(hào)培養(yǎng)基，28 ℃倒置培養(yǎng)4 d。計(jì)數(shù)各誘變處理時(shí)間對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)菌落數(shù)。以對(duì)照組致死率為0%制作DES致死率曲線。致死率的計(jì)算公式如下：

式中：N0為10-4CFU/mL時(shí)對(duì)照組菌落數(shù)，Nt為10-4CFU/mL時(shí)誘變劑處理tmin后菌落數(shù)。

1.2.3 DES正式誘變 依據(jù)DES致死率曲線，選擇在1% DES誘變處理時(shí)致死率90%所對(duì)應(yīng)的處理時(shí)間進(jìn)行正式誘變。操作步驟同1.2.2節(jié)的方法,得到正式誘變完畢的突變株菌懸液。

1.2.4 解除氮代謝分解調(diào)節(jié)菌株的獲得 雞羽毛降解時(shí)會(huì)在降解體系中產(chǎn)生大量的色氨酸[23]。當(dāng)環(huán)境中存在基礎(chǔ)氮源(如氨基酸)時(shí)，菌株的代謝調(diào)控會(huì)阻遏蛋白酶產(chǎn)生[24]。因此，將突變株菌懸液涂布在解除氮代謝分解調(diào)節(jié)篩選培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)，以期獲得解除氮源分解調(diào)節(jié)的突變株。10 d后，長(zhǎng)出可供挑取單菌落。將單菌落挑取到24孔板(每孔1 mL TSB培養(yǎng)基)中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。收取菌液，離心后棄上清，得到突變株庫(kù)。加入50%甘油，于-80 ℃冰箱中長(zhǎng)期保存。

1.3 突變株的篩選

1.3.1 牛奶培養(yǎng)基初篩 將1.2.4節(jié)突變株庫(kù)及野生型BJA-103菌株于3 000 r/min離心10 min。用移液槍頭伸入突變株或野生型BJA-103菌株菌泥中吸取20 μL菌泥，點(diǎn)植法接種在牛奶培養(yǎng)基上。風(fēng)干30 min后，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d。記錄突變株及野生型BJA-103菌株菌落大小與對(duì)應(yīng)牛奶水解圈寬度，選擇水解圈盡量寬的突變株進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.2 羽毛降解復(fù)篩 選擇水解圈盡量寬的突變株，在TSB搖瓶培養(yǎng)基中活化，36 h后繼續(xù)轉(zhuǎn)接到下一個(gè)TSB搖瓶培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。重復(fù)該傳代培養(yǎng)步驟5次。將突變株轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)培養(yǎng)基中，取相同面積菌落接種到TSB搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 h為種子液。再將種子液按照2%接種量轉(zhuǎn)接到羽毛降解培養(yǎng)基中，置于28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)以降解羽毛。每24 h取樣測(cè)定羽毛降解率，共取樣6次，每次3個(gè)重復(fù)。取出樣品后，10 000 r/min離心保存上清液，在沉淀中加入TE 25S buffer(0.3 mol/L蔗糖，25 mmol/L Tris-HCl，25 mmol/L EDTA，pH 8.0) 6 mL重新懸浮沉淀，并在重懸沉淀中加入100 mg/mL溶菌酶1.4 mL，37 ℃水浴2 h徹底酶解破碎菌絲體。最后將保存的上清液與酶解后重懸沉淀使用Whatman No.1濾紙抽濾。

采用減質(zhì)量法[23]測(cè)定羽毛降解率，選擇羽毛降解速率最快、最終降解程度最大的菌株作為復(fù)篩得到的突變株。羽毛降解率計(jì)算公式如下：

式中：A為培養(yǎng)基中羽毛總質(zhì)量，B為發(fā)酵完畢后濾紙和未降解羽毛質(zhì)量，C為濾紙質(zhì)量。

1.4 突變株角蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

1.4.1 角蛋白酶活性測(cè)定 使用福林酚法[25]測(cè)定角蛋白酶活性。取羽毛降解搖瓶，4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，取上清液為角蛋白酶粗酶液(以下簡(jiǎn)稱為粗酶液)。使用0.45 μm的水系濾頭過(guò)濾粗酶液，除去懸浮菌體與未沉淀的羽毛碎片。40 ℃水浴鍋中預(yù)熱2 min。每1 mL粗酶液加入2%角蛋白1 mL立即精確反應(yīng)10 min，對(duì)照組中加入0.1 mol/L PBS(pH 7.2，角蛋白溶劑)1 mL。反應(yīng)完畢后，加入0.4 mol/L 三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，繼續(xù)孵育20 min。孵育完畢后10 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加入5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液與1 mL福林酚試劑，在40 ℃水浴中發(fā)色20 min。最后沖涼，測(cè)定660 nm下吸光度。每1 mL體系精確反應(yīng)10 min產(chǎn)生1 μg氨基酸為一個(gè)突變株角蛋白酶活性單位，即1 U。

1.4.2 降解時(shí)間對(duì)角蛋白酶活性的影響 將突變株在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上活化，取固定面積菌落接種到TSB搖瓶培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)28～36 h為種子液。按2%接種量將種子液轉(zhuǎn)接到羽毛降解培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)。每24 h取樣1次，共取樣6次，測(cè)定角蛋白酶活性，每次設(shè)置1個(gè)對(duì)照組與3個(gè)試驗(yàn)組。確定在羽毛降解過(guò)程中突變株角蛋白酶活性最大的時(shí)刻。

1.4.3 溫度對(duì)角蛋白酶活性的影響 按照平板活化、種子液活化、羽毛降解培養(yǎng)方法，將突變株培養(yǎng)至角蛋白酶活性最大的時(shí)刻。反應(yīng)pH恒定為7，設(shè)置溫度梯度20，30，40，50，60，70，80 ℃進(jìn)行角蛋白酶活性測(cè)定。每個(gè)溫度梯度設(shè)置1個(gè)對(duì)照組與3個(gè)試驗(yàn)組。

1.4.4 pH對(duì)角蛋白酶活性的影響 按照平板活化、種子液活化、羽毛降解培養(yǎng)方法，將突變株培養(yǎng)至角蛋白酶活性最大的時(shí)刻。反應(yīng)溫度恒定為40 ℃，設(shè)置pH梯度4，5，6，7，8，9，10，11，12進(jìn)行角蛋白酶活性測(cè)定。測(cè)定時(shí)采用對(duì)應(yīng)pH緩沖液懸浮角蛋白，對(duì)照組中加入對(duì)應(yīng)pH緩沖液。每個(gè)pH梯度設(shè)置1個(gè)對(duì)照組與3個(gè)試驗(yàn)組。

2 結(jié)果與分析

2.1 BJA-103誘變菌株的獲得

由圖1可知，1% DES處理BJA-103菌株菌懸液，當(dāng)處理時(shí)間為80 min時(shí)，致死率為99%。由于在誘變育種中，高致死率通常會(huì)產(chǎn)生大規(guī)模的負(fù)突變[20]，增加篩選難度。故依據(jù)圖1，在正式誘變中選擇1% DES處理65 min(致死率90%)。通過(guò)解除氮代謝分解調(diào)節(jié)篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑取生長(zhǎng)速率快、可穩(wěn)定遺傳的單菌落突變株共1 253株。菌株編號(hào)以72個(gè)為一組，每組首字母分別為A，B，C，…，R。則第1組前26株突變株編號(hào)為AA，AB，AC，…，AZ；隨后26株突變株編號(hào)為AA′，AB′，AC′，…，AZ′；最后20株突變株編號(hào)為A1，A2，A3，…，A20，以此類推。

圖1 DES處理BJA-103誘變菌株的致死率曲線Fig.1 Mortality rate of DES treatment of BJA-103

2.2 BJA-103誘變菌株的篩選

2.2.1 牛奶培養(yǎng)基初篩 圖2顯示，BJA-103誘變菌株牛奶水解圈寬度占比分布整體偏向大于其所擬合正態(tài)分布曲線期望值的一側(cè)。這說(shuō)明在獲得解除氮代謝分解調(diào)節(jié)突變株庫(kù)時(shí)，培養(yǎng)基中過(guò)量的色氨酸產(chǎn)生了篩選壓力，且起到了明顯作用。因此，挑取的突變株單菌落具有更高的蛋白酶生產(chǎn)基礎(chǔ)值，能產(chǎn)生更大的水解圈。初篩去掉大量水解圈較小的突變株，僅對(duì)水解圈寬度在8.5～12 mm的5株突變株(RT、BM′、CV′、FX′、NK′)進(jìn)行羽毛降解復(fù)篩。

圖2 BJA-103誘變菌株牛奶水解圈寬度占比的分布Fig.2 Distribution of ratio of hydrolysis halos length of mutants from BJA-103

2.2.2 羽毛降解復(fù)篩 對(duì)5株突變株(RT、BM′、CV′、FX′、NK′)以及野生型菌株BJA-103進(jìn)行羽毛降解試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，羽毛降解48 h時(shí)，野生型BJA-103的羽毛降解率為12.82%，F(xiàn)X′和NK′的羽毛降解率分別為64.04%和65.29%。因此，淘汰掉在同一羽毛降解時(shí)間下降解速率明顯偏低的突變株RT、BM′和CV′。隨著羽毛降解試驗(yàn)的繼續(xù)進(jìn)行，F(xiàn)X′在降解72 h時(shí)降解作用基本結(jié)束，在降解144 h時(shí)最終降解率為87.52%。NK′在降解72～144 h期間仍能保持較強(qiáng)羽毛降解能力，在降解144 h時(shí)最終降解率為90.74%。故選擇降解速率較快，且最終降解率較高的突變株NK′作為復(fù)篩得到的突變株。

表1 不同降解時(shí)間下野生型BJA-103菌株及其突變株的羽毛降解率Table 1 Feather-degrading rate of wild-type and mutants of BJA-103 under different degrading times

2.3 突變株NK′角蛋白酶的初步酶學(xué)探究

2.3.1 降解時(shí)間 由圖3可知，突變株NK′角蛋白酶活性在羽毛降解24～72 h內(nèi)快速上升，并在72 h處有最大值(41.6 U)，之后隨著羽毛降解時(shí)間的延長(zhǎng)，角蛋白酶活性逐步下降。因此，選擇72 h為最適產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間，以指導(dǎo)溫度與pH對(duì)突變株NK′角蛋白酶活性影響試驗(yàn)。

圖3 降解時(shí)間對(duì)突變株NK′角蛋白酶活性的影響Fig.3 Effect of feather-degrading time on keratinase activity of mutant NK′

2.3.2 溫 度 由圖4可知，突變株NK′角蛋白酶活性隨著反應(yīng)溫度由20～70 ℃的上升而快速增加，并在70 ℃處有最大值(114.2 U)，之后隨著反應(yīng)溫度的進(jìn)一步上升，角蛋白酶活性快速下降。因此，70 ℃為該酶最適反應(yīng)溫度，說(shuō)明該角蛋白酶具有一定程度的耐高溫能力。

圖4 溫度對(duì)突變株NK′角蛋白酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on keratinase activity of mutant NK′

2.3.3 pH 由圖5可知，突變株NK′角蛋白酶活性隨著反應(yīng)pH由4～11的升高而快速增加，并在pH 11處有最大值(63.1 U)，之后隨著反應(yīng)pH進(jìn)一步升高為12，角蛋白酶活性略微下降(59.8 U)。

因此，pH 11為該酶的最適反應(yīng)pH，說(shuō)明該角蛋白酶具有較強(qiáng)耐堿性環(huán)境的能力。

3 討論與結(jié)論

本誘變育種試驗(yàn)中引入了“解除氮代謝分解調(diào)節(jié)”這一篩選步驟，有效抑制了無(wú)解除氮源分解調(diào)節(jié)突變株的生長(zhǎng)[26-27]。1 253株突變株對(duì)應(yīng)的牛奶水解圈寬度占比整體偏向于其所擬合正態(tài)分布曲線期望值大的一側(cè)，表明獲得的單菌落突變體庫(kù)有著“具有更高的蛋白酶生產(chǎn)基礎(chǔ)值”的特征。羽毛降解復(fù)篩前，對(duì)突變株RT、BM′、CV′、FX′和NK′連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，保證遺傳穩(wěn)定性，防止復(fù)篩過(guò)程中因?yàn)檫z傳不穩(wěn)定造成的菌株退化。本研究最終篩選獲得突變株NK′，該突變株的羽毛降解能力強(qiáng)，在發(fā)酵48 h時(shí)羽毛降解效率為野生型BJA-103菌株的5倍。突變株NK′在發(fā)酵72 h時(shí)角蛋白酶活性最高(41.6 U)；該角蛋白酶最適反應(yīng)溫度為70 ℃時(shí)，對(duì)應(yīng)角蛋白酶活性為114.2 U；最適反應(yīng)pH為11時(shí)，對(duì)應(yīng)角蛋白酶活性為63.1 U。

目前，耐高溫酶及耐堿酶是工業(yè)應(yīng)用明星酶，也是研究的熱點(diǎn)之一[28]。在進(jìn)一步降解/發(fā)酵試驗(yàn)后，突變株NK′有希望作為工業(yè)羽毛降解菌/酶投入應(yīng)用。后續(xù)試驗(yàn)中，可對(duì)突變株NK′的角蛋白酶編碼基因進(jìn)行進(jìn)一步研究，對(duì)比野生型BJA-103菌株角蛋白酶編碼基因，可以為相關(guān)代謝通路的構(gòu)建提供理論依據(jù)。