樹型金銀花與野生金銀花HPLC指紋圖譜對比研究

鄧寒霜，李筱玲，趙月梅，王新軍，楊文怡，賀 博，潘月娜

(1 商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000；2 陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,陜西 商洛 726000；3 貴州師范學(xué)院 生物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550018；4 陜西天士力植物藥業(yè)有限公司,陜西 商洛 726000)

金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或初開的花[1]，具有解毒清熱、疏散風(fēng)熱之功效，可用于溫病發(fā)熱、風(fēng)熱感冒等證[2]。金銀花中主要含有黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸及三萜類成分[3-5]，《中國藥典》(2015年版)以綠原酸、木犀草苷為指標(biāo)性成分控制金銀花藥材質(zhì)量。現(xiàn)代藥理研究表明，金銀花具有抑菌、消炎、抗病毒、抗腫瘤、保肝等作用[6-8]。金銀花藥用歷史悠久，為大宗常用藥材，同時又是一種健康的藥食兩用植物，市場需求量大[9-11]。金銀花的抗病毒作用在治療“非典”和“新冠”肺炎中得到了很好應(yīng)用，以其為主要原料藥的“雙黃連”“連花清溫膠囊”等中成藥的熱銷，帶動了金銀花市場需求的進(jìn)一步增長[12-15]。

陜西省商洛市位于秦嶺南麓東段，地跨長江、黃河兩個流域，南北氣候分界線從市內(nèi)穿境而過，北部屬暖溫帶、南部屬北亞熱帶氣候，地質(zhì)、氣候條件的多樣性造就了商洛豐富的藥用植物資源。商洛藥材種植歷史悠久，是金銀花的主產(chǎn)區(qū)之一，年產(chǎn)金銀花在100～500 t。然而傳統(tǒng)藤本金銀花產(chǎn)量低、采摘費(fèi)工且適宜采收期短，藥農(nóng)種植積極性不高。樹型金銀花是傳統(tǒng)金銀花經(jīng)人工選育改良的栽培品種，其花蕾大、花針長、花瓣厚，產(chǎn)量高，植株生長快，花枝短，采收省時省工，深受藥農(nóng)青睞[16]。2012年以來，樹型金銀花開始在商洛丹鳳、洛南等地規(guī)?；N種植。

中藥及其制劑均為多組分復(fù)雜體系，僅用少數(shù)幾種指標(biāo)性成分難以全面準(zhǔn)確地評價中藥質(zhì)量。中藥HPLC指紋圖譜是一種綜合的、可量化的中藥質(zhì)量控制技術(shù)。HPLC指紋圖譜能夠提供豐富的鑒別信息，較為全面地反映中藥化學(xué)成分的種類與數(shù)量，符合中醫(yī)藥整體觀理念，可對藥品質(zhì)量進(jìn)行客觀、整體、綜合的評價，進(jìn)而確保中藥質(zhì)量的可控性和穩(wěn)定性。世界衛(wèi)生組織已將指紋圖譜技術(shù)作為中草藥評價的主要技術(shù)[17]。本研究對栽培于陜西商洛、安康等地的13份樹型金銀花樣品，以及采自商洛市和毗鄰的河南省部分地區(qū)的12份野生金銀花樣品進(jìn)行分析，構(gòu)建2種不同金銀花的HPLC指紋圖譜，通過聚類分析，初步探明不同地區(qū)、品種間金銀花的關(guān)系，以期為后期快速鑒定金銀花品種、評價金銀花質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用13份樹型金銀花樣品收集自陜西商洛、安康等地的金銀花種植基地；12份野生金銀花樣品采自陜西洛南、丹鳳以及河南省靈寶市等地。全部樣品經(jīng)商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院李筱玲執(zhí)業(yè)藥師鑒定為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾，各樣品來源詳細(xì)信息見表1。

表1 供試2種金銀花樣品來源信息Table 1 Source information of two kinds of honeysuckle samples

綠原酸、異綠原酸、木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品,均購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司(定量分析用，20 mg)。高效液相色譜儀，島津LC-20A型(四元泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣品、柱溫箱、PDA檢測器)。

1.2 樣品溶液的制備

1.2.1 供試品溶液 取金銀花干燥樣品適量，粉碎，過3號藥典篩(24目，篩孔內(nèi)徑355 μm±13 μm)。精密稱取金銀花樣品粉末0.5 g，置具塞平底燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇25 mL，稱質(zhì)量，超聲(40 kHz，250 W)提取30 min，冷卻，再次稱質(zhì)量，以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇補(bǔ)足原質(zhì)量，即得供試品溶液。0.45 μm微孔濾膜過濾，備用[18]。

1.2.2 混合對照品溶液 分別取綠原酸、異綠原酸、木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱質(zhì)量，置10 mL容量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶解并定容至刻度，即得綠原酸0.50 mg/mL、異綠原酸0.43 mg/mL、木犀草苷0.26 mg/mL的混合對照品溶液。0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3 HPLC分析

Hypersil Gold C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，流動相：甲醇(A)、體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸(B)，按表2所示程序進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長270 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫 30 ℃。在該色譜條件下，樣品各組分可獲得良好分離。

表2 金銀花樣品HPLC分析梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure for HPLC analysis of honeysuckle

1.4 指紋圖譜分析

取供試品溶液適量進(jìn)行HPLC檢測，記錄55 min內(nèi)的色譜圖。將AIA格式的HPLC分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版)”進(jìn)行分析處理。選擇峰面積較大、穩(wěn)定、分離度好、干擾少的綠原酸色譜峰為參照峰，以其保留時間和峰面積為參照，計(jì)算其他各組分色譜峰的相對保留時間、相對峰面積，采用中位數(shù)法進(jìn)行多點(diǎn)校正，分別建立樹型金銀花、野生金銀花的對照指紋圖譜，計(jì)算各批次樣品之間，以及各樣品與對照指紋圖譜間的相似度S。具體計(jì)算方法見文獻(xiàn)[17,19]。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 基線考察 取體積分?jǐn)?shù)50%乙醇適量，0.45 μm微孔濾膜過濾后精密吸取10 μL，進(jìn)樣，按1.3節(jié)色譜條件分析，記錄色譜數(shù)據(jù)，作為陰性對照。

1.5.2 精密度考察 取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣10次，記錄色譜數(shù)據(jù)，比較各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察所用儀器的精密度。

1.5.3 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別在制備后0，4，8，12，24 h進(jìn)樣，比較各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積和相對峰面積的RSD，考察該樣品溶液的穩(wěn)定性。

1.5.4 重復(fù)性考察 取同一金銀花樣品，平行處理成10份供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜數(shù)據(jù)，比較各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積和相對峰面積的RSD，考察供試品制備方法的重現(xiàn)性。

1.5.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 另行收集部分金銀花樣品，按1.4節(jié)的方法建立指紋圖譜，以研究所得2種金銀花HPLC對照指紋圖譜為對照計(jì)算相似度，對研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 聚類分析

以共有峰的相對峰面積為評價指標(biāo)，利用SPSS 13.0軟件，采用離差平方和法分別對2種金銀花樣品進(jìn)行聚類分析。

1.7 有效成分含量測定

取供試品溶液適量，按1.3節(jié)條件進(jìn)行HPLC分析，以綠原酸、異綠原酸、木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品為對照，采用外標(biāo)法，對2種金銀花各樣品中的上述3種成分含量進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種金銀花HPLC指紋圖譜的建立

利用2種金銀花各樣品HPLC數(shù)據(jù)建立其對照指紋圖譜。樹型金銀花各樣品指紋圖譜中，峰面積達(dá)10 000以上的共有峰為13個；野生金銀花各樣品指紋圖譜中，峰面積達(dá)10 000以上的共有峰為28個。各樣品指紋圖譜、對照指紋圖譜、混合對照品色譜圖見圖1，各樣品共有峰檢測和相似度計(jì)算結(jié)果見表3～5。

由圖1和表3可知，相較于樹型金銀花，野生金銀花的HPLC指紋圖譜更復(fù)雜，共有峰數(shù)目更多，約為樹型金銀花的2.2倍。表明野生金銀花中含有更多的化學(xué)成分，提示其藥理作用可能與栽培品種有別。

表3 2種金銀花指紋圖譜的共有峰匹配結(jié)果Table 3 Matching of common peaks in fingerprints of two varieties of honeysuckle

a.樹型金銀花對照指紋圖譜；b.13批樹型金銀花樣品指紋圖譜；c.野生金銀花對照指紋圖譜；d.12批野生金銀花指紋圖譜；e.混合對照品色譜圖；f.陰性對照色譜圖；1.綠原酸；2.異綠原酸；3.木犀草苷a.Comparative fingerprint of tree type honeysuckle;b.Fingerprint of 13 tree type honeysuckle samples;c.Comparative fingerprint of wild honeysuckle;d.Fingerprint of 12 wild honeysuckle;e.Chromatogram of mixed reference substance;f.Negative control;1.Chlorogenic acid;2.Isochlorogenic acid;3.Luteolin

由表4可知，12份野生金銀花樣品中有10份樣品與對照指紋圖譜的相似度在0.95以上；由表5可知，13份樹型金銀花樣品中有12份與對照指紋圖譜的相似度在0.95以上，表明2種金銀花的對照指紋圖譜可以準(zhǔn)確描述各自品種的HPLC特征；有24份樣品與對照指紋圖譜相似度達(dá)0.90以上。同時，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版)”計(jì)算得2種金銀花對照指紋圖譜間的相似度僅為0.329，表明本研究所得金銀花對照指紋圖譜具有良好的辨識度，可用于金銀花品種的快速區(qū)分。

表4 12份野生金銀花指紋圖譜的相似度計(jì)算結(jié)果Table 4 Similarity calculation results of fingerprint of wild honeysuckle

表5 13份樹型金銀花指紋圖譜的相似度計(jì)算結(jié)果Table 5 Similarity calculation of fingerprint of tree type honeysuckle

由表4和表5數(shù)據(jù)計(jì)算可得，野生金銀花各樣品間的相似度平均值為0.936，RSD為5.27%；樹型金銀花各樣品間的相似度平均值為0.950，RSD為3.74%，由此可知，樹型金銀花指紋圖譜穩(wěn)定性較野生金銀花好。說明作為栽培品種的樹型金銀花，在統(tǒng)一規(guī)范的人工栽培條件下，其品質(zhì)較野生金銀花穩(wěn)定，更符合藥品質(zhì)量穩(wěn)定性、均一性的要求。

2.2 金銀花色譜測定方法學(xué)考察結(jié)果

由圖1可知，在本研究試驗(yàn)條件下所得色譜圖的基線平穩(wěn)，對樣品分析無干擾。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察試驗(yàn)結(jié)果所得RSD值均<1.00%，表明本研究所用儀器精密度高，樣品溶液制備方法重復(fù)性好，在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

另行收集樹型金銀花樣品12份，野生金銀花樣品5份，對研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，具體結(jié)果見表6 。由表6可知，1～12號驗(yàn)證試驗(yàn)用樣品與樹型金銀花對照指紋圖譜間的相似度在0.934～0.997，與野生金銀花對照指紋圖譜間的相似度均<0.4，表明此部分樣品為樹型金銀花；13～17號驗(yàn)證樣品與野生金銀花對照指紋圖譜間相似度在0.908～0.987，同時與樹型金銀花對照指紋圖譜間的相似度均在0.65以下，表明這5份樣品為野生金銀花。2種金銀花類型的鑒別結(jié)果與樣品提供者所提供信息一致，證明本研究所得對照指紋圖譜可快速區(qū)別2種金銀花。

表6 2種金銀花對照指紋圖譜驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Verification of two kinds of honeysuckle control fingerprints

2.3 2種金銀花的聚類分析結(jié)果

根據(jù)樹型金銀花及野生金銀花HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，12份野生金銀花樣品可分為4個分支，其中洛南石坡、洛南巡檢、洛南靈口、洛南景村4地樣品(Y1～Y4)聚為一支，河南靈寶的2份樣品(Y11和Y12)為一支，丹鳳鐵峪鋪、丹鳳武關(guān)、丹鳳蔡川、丹鳳留仙坪4地樣品(Y5～Y8)為一支，丹鳳花瓶子、丹鳳竹林關(guān)2地樣品(Y9和Y10)為一支。樹型金銀花樣品也可分成4個分支，其中洛南景村(S3)、安康樊坡(S13)、安康大河鎮(zhèn)(S10)、安康構(gòu)元(S12)、洛南寺坡(S6)、漢中大河壩(S8)、丹鳳武關(guān)(S2)、丹鳳鐵峪鋪(S9)、丹鳳花瓶子(S7)、丹鳳竹林關(guān)(S5)等來自陜南各地的樣品為一支；渭南蒲城(S4)、西安鄠邑(S11)、河南靈寶(S1)3地各為1支。

Y1～Y12,S1～S13所示樣品與表1同Y1-Y12,S1-S13 samples are the same as Table 1圖2 金銀花樣品聚類分析結(jié)果Fig.2 Cluster analysis of honeysuckle samples

聚類結(jié)果表明，野生金銀花品質(zhì)與產(chǎn)地密切相關(guān)，產(chǎn)于同一縣區(qū)的樣品基本上歸為一類，其中丹鳳縣花瓶子、竹林關(guān)較其他幾個產(chǎn)地更為偏南，因此與其他樣品差異更大。樹型金銀花中，產(chǎn)于陜南各地的10個樣品差異不大，基本上歸為一類；產(chǎn)于渭南蒲城、西安鄠邑、河南靈寶3地樣品差異較大，特別是產(chǎn)于河南靈寶樣品與陜西各地樣品均存在較大差異，可單獨(dú)為一類。究其原因應(yīng)是，樹型金銀花樣品均采自人工種植基地，在環(huán)境、氣候條件差異不大的陜南地區(qū)，以統(tǒng)一、規(guī)范人工技術(shù)栽培而成的藥材，其品質(zhì)具有良好的穩(wěn)定性。而另外3個樣品，因?yàn)榄h(huán)境、氣候、種植技術(shù)等因素差異，造成樣品差異較大。

2.4 2種金銀花中有效成分含量

2種金銀花中的有效成分含量測定結(jié)果見表7。由表7可知，野生金銀花樣品中的綠原酸、異綠原酸、木犀草苷3種成分平均含量分別為3.72%，0.39%，0.15%；樹型金銀花樣品分別為3.42%，1.22%，0.06%。不同產(chǎn)地的野生金銀花有效成分含量存在明顯差異，其RSD值在75%以上，表明環(huán)境因素對野生金銀花品質(zhì)影響較大。其中來自商洛市洛南縣的4個樣品含量較為接近，且均明顯高于《中國藥典》(2015年版)中金銀花“綠原酸不得少于1.5%，木犀草苷不得少于0.05%”的要求。說明洛南縣為野生金銀花適宜生長區(qū)，產(chǎn)于該縣的野生金銀花品質(zhì)優(yōu)良。13份樹型金銀花有效成分含量相對較為穩(wěn)定，進(jìn)一步說明規(guī)范化種植有助于保證藥材品質(zhì)的一致性。

表7 2種金銀花樣品中有效成分含量測定結(jié)果Table 7 Determination of effective components in honeysuckle samples %

3 討 論

近年來，金銀花藥材及以其為主要原料藥的中藥成方制劑的指紋圖譜研究工作取得了良好進(jìn)展：丁潔等[13]對金銀花多糖的指紋圖譜及體外抗病毒活性進(jìn)行了研究，陳梓媛等[20]運(yùn)用指紋圖譜技術(shù)建立了金銀花配方顆粒質(zhì)量的快速檢測方法；范毅等[18]確立了可準(zhǔn)確評價藥材質(zhì)量的金銀花提取物指紋圖譜，標(biāo)定共有峰12個，該方法需通過前處理制備金銀花藥材提取物；劉天亮等[21]基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物技術(shù)提出了金銀花指紋圖譜體系構(gòu)建的新思路。近年來，樹型金銀花特別是其新品種“金花3號”，因花期長、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，種植面積逐年增加[22-23]。本研究利用HPLC指紋圖譜技術(shù)對樹型金銀花與野生傳統(tǒng)藤本金銀花進(jìn)行了對比分析，建立了2個品種的對照指紋圖譜。與現(xiàn)有文獻(xiàn)方法相比，本研究建立了一種快速鑒別2種金銀花類型的新方法，且樣品溶液制備方法更簡便，指紋圖譜共有峰更多。

本研究結(jié)果表明，2種金銀花品種全部25份樣品中，有24個樣品與各自對照指紋圖譜的相似度在0.90以上，2種金銀花對照指紋圖譜間的相似度僅為0.329。從聚類分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)于陜南的樹型金銀花與來自關(guān)中及河南等地的樹型金銀花具有一定的區(qū)別。通過驗(yàn)證試驗(yàn)證明，本研究所得對照指紋圖譜具有很好的辨識度，可以用來快速區(qū)分樹型金銀花與野生傳統(tǒng)藤本金銀花。

從本研究所得HPLC指紋圖譜及共有峰數(shù)據(jù)可以看出，野生金銀花中化學(xué)成分更豐富，含某些樹型金銀花中未有之化學(xué)物質(zhì)。同時有些野生金銀花中的有效成分含量明顯高于樹型金銀花，表明野生金銀花可能具有某些樹型金銀花不具備的藥理作用。這將是本課題組后續(xù)研究的方向和重點(diǎn)。此外，不同產(chǎn)地野生金銀花的指紋圖譜相似度、有效成分含量、聚類分析結(jié)果均存在較大差異，表明野生金銀花質(zhì)量易受環(huán)境、氣候因素影響，品質(zhì)不穩(wěn)定；某些產(chǎn)地藥材含量極高，某些藥材又達(dá)不到藥典標(biāo)準(zhǔn)，造成以之為原料的中成藥質(zhì)量不穩(wěn)定，不符合藥品質(zhì)量控制要求，不利于中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展，這種不確定性也會為臨床用藥帶來隱患。與野生金銀花相比，樹型金銀花指紋圖譜相似度更高、有效成分含量更穩(wěn)定。聚類分析結(jié)果也表明，產(chǎn)于氣候類型、環(huán)境條件類似的陜南地區(qū)的樹型金銀花性質(zhì)接近，質(zhì)量非常穩(wěn)定，更符合藥品質(zhì)量穩(wěn)定性、均一性的要求。研究結(jié)果進(jìn)一步證明,規(guī)范化種植有助于確保藥材質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性，且商洛市洛南縣為金銀花適生區(qū)，產(chǎn)于該縣的野生金銀花品質(zhì)優(yōu)良。當(dāng)?shù)卣畱?yīng)在該縣加強(qiáng)引導(dǎo)，引入良種，再輔以有效的技術(shù)指導(dǎo)，以促進(jìn)當(dāng)?shù)刂兴幉漠a(chǎn)業(yè)發(fā)展。