基于RNA測(cè)序?qū)Ψ蜗侔┖喜⒎嗡ㄈ磉_(dá)譜的生物信息學(xué)分析

王清鶴 曹國(guó)磊 張秀華 王景 馬榮輝 羅琴

1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)科，烏魯木齊 830011；2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院體檢中心，烏魯木齊 830011

肺栓塞，也稱肺血栓栓塞癥，是以各種栓子阻塞肺動(dòng)脈系統(tǒng)為發(fā)病原因的一組疾病或臨床綜合征的總稱，屬于靜脈栓塞的一種類型[1]。肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的癌癥，而肺腺癌作為肺癌中最常見(jiàn)的一種病理類型，是肺癌患者發(fā)生肺栓塞的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。多個(gè)臨床研究已經(jīng)證實(shí)肺栓塞的發(fā)生與肺癌患者病死率的增加密切相關(guān)[3-4]。目前針對(duì)肺腺癌合并肺栓塞的致病相關(guān)機(jī)制尚未得到充分研究。本研究運(yùn)用高通量RNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析方法篩選肺腺癌合并PE相關(guān)的差異基因，探討其發(fā)生的分子機(jī)制，為其早期診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 前瞻性研究。選取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2019年1～12月住院的肺腺癌合并肺栓塞患者4例為肺腺癌合并肺栓塞組，男3例，女1例；年齡范圍為31～62歲，年齡(48.5±12.9)歲，中位年齡50.5歲。選取同期入院的單純肺腺癌患者4例為肺腺癌組，男2例，女2例；年齡范圍為40～75歲，年齡(58.5±15.3)歲，中位年齡59.5歲。選取同期入院的單純肺栓塞患者4例為肺栓塞組，男3例，女1例；年齡范圍為40～80歲，年齡(60.3±16.4)歲，中位年齡60.5歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：肺腺癌診斷由組織病理學(xué)證實(shí)，無(wú)肺栓塞病史，無(wú)重要臟器嚴(yán)重疾病。肺栓塞的診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)《肺血栓栓塞癥診治與預(yù)防指南》2018版[1]。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者有其他惡性腫瘤病史，有凝血功能障礙，近期使用過(guò)影響凝血的藥物。肺腺癌合并肺栓塞患者為肺腺癌診斷前3個(gè)月或診斷后24個(gè)月內(nèi)發(fā)生的肺栓塞。所有患者均知情同意，本研究已通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2019BC007)。

1.2 RNA提取和測(cè)序 每例患者于入院后24 h內(nèi)采集2.5 ml靜脈血，保存于-80℃冰箱，待標(biāo)本收集完成后，使用Trizol(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596026)按照說(shuō)明書(shū)提取所獲全血總RNA。每個(gè)樣品取3μg總RNA構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)，文庫(kù)測(cè)序由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 獲取共同差異表達(dá)基因 對(duì)測(cè)序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和歸一化處理后，采用R語(yǔ)言中的LIMMA軟件包及DESeqR軟件包分析肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺腺癌組、肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺栓塞組基因的差異表達(dá)。差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)|log FC|≥2；(2)P≤0.05，提取差異基因并進(jìn)行基因名注釋，繪制兩對(duì)比組差異基因火山圖，并使用Venny在線工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪 制 韋 恩圖，將兩對(duì)比組差異基因經(jīng)Excel軟件取交集，選擇兩對(duì)比組中共有的差異基因，稱之為共同差異基因。

1.4 基因本體(GO)及京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)富集分析 使用Metascape網(wǎng)站(http://metascape.org/gp/index.html)對(duì)篩選后的共同差異基因進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分 析(分 析 參 數(shù)：Min Overlap≥3，Min Enrichment≥1.5，P＜0.05)，通過(guò)Fisher Exact Test計(jì)算P值，以P＜0.05作為篩選條件。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌合并肺栓塞組、肺腺癌組及肺栓塞組差異基因表達(dá)譜 獲得差異基因后，剔除FPKM小于0的基因。在肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺腺癌組中共鑒定出519個(gè)差異基因，包括357個(gè)上調(diào)基因和162個(gè)下調(diào)基因；在肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺栓塞組中共鑒定出828個(gè)差異基因，包括455個(gè)上調(diào)基因和373個(gè)下調(diào)基因。將兩對(duì)比組差異基因取交集，共得到147個(gè)共同差異基因，其中上調(diào)基因80個(gè)，下調(diào)基因67個(gè)(圖1)。按照差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值由大到小將共同上下調(diào)差異基因進(jìn)行排列，見(jiàn)表1。

圖1 肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺腺癌組、肺栓塞組差異基因火山圖及韋恩圖 A：肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺腺癌組差異基因火山圖；B：肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺栓塞組差異基因火山圖；C：肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺腺癌組及肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺栓塞組差異基因韋恩圖

表1 肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺腺癌組、肺栓塞組的共同上下調(diào)差異基因(各前5個(gè))

2.2 差異基因GO及KEGG富集分析 將共同差異基因輸入Matescape進(jìn)行富集分析，GO分析發(fā)現(xiàn)兩對(duì)比組共同差異基因主要富集于中性粒細(xì)胞活化、軸突發(fā)育、白細(xì)胞分化、防御反應(yīng)的負(fù)調(diào)控、髓系細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等過(guò)程(圖2)。KEGG通路分析表明，共同差異基因主要參與代謝途徑、肺結(jié)核、癌癥途徑、血小板活化等通路(表2)。

圖2 肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺腺癌組、肺栓塞組的共同差異基因富集的GO條目(前20條)

表2 肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺腺癌組、肺栓塞組的共同差異基因富集的KEGG通路(前10條)

3 討論

研究表明癌癥可誘導(dǎo)凝血系統(tǒng)的激活，進(jìn)而刺激腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散[5]。肺腺癌合并肺栓塞既與腫瘤相關(guān)又與栓塞聯(lián)系，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且影響因素眾多。目前研究認(rèn)為肺栓塞的形成主要與凝血系統(tǒng)的激活、血管內(nèi)皮損傷、炎癥因子表達(dá)增加等機(jī)制有關(guān)，尚缺乏相關(guān)分子機(jī)制研究。本研究利用RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)肺腺癌合并肺栓塞、單純肺腺癌以及單純肺栓塞患者外周血RNA進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測(cè)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共篩選出147個(gè)共同差異基因，包括80個(gè)上調(diào)基因，67個(gè)下調(diào)基因。通過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn)，兩對(duì)比組共同差異基因主要參與中性粒細(xì)胞活化、軸突發(fā)育、白細(xì)胞分化等生物學(xué)過(guò)程。已有多項(xiàng)研究報(bào)道白細(xì)胞增多等炎癥反應(yīng)與癌癥患者患靜脈栓塞風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[6-7]，中性粒細(xì)胞可能通過(guò)產(chǎn)生中性粒細(xì)胞胞外陷阱來(lái)促進(jìn)血栓形成[8]。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，共同差異基因與代謝途徑、癌癥途徑、血小板活化等通路聯(lián)系密切。而有研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞通過(guò)激活血小板活化誘導(dǎo)血小板聚集，這一過(guò)程與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)[9-10]，與本研究結(jié)果相類似。

本研究選擇P值最小的前5個(gè)上下調(diào)共同差異基因進(jìn)行分析，其中PRTN3是目前研究較為深入的基因。PRTN3編碼絲氨酸蛋白酶3，其誘導(dǎo)加工促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α、IL-8和IL-1β，這些因子已明確在包括肺癌的各種腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用[11-12]。絲氨酸蛋白酶3還可通過(guò)干擾巨噬細(xì)胞的激活[13]、破壞細(xì)胞外基質(zhì)[14]以及黏附中性粒細(xì)胞胞外陷阱[15]導(dǎo)致血管壞死及肺組織內(nèi)皮的損傷，內(nèi)皮損傷是血栓形成的重要機(jī)制之一。與絲氨酸蛋白酶3緊密聯(lián)系的CD177基因也是共同差異基因，CD177編碼CD177糖蛋白，在中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移過(guò)程中參與炎癥反應(yīng)[16]。而先前的研究發(fā)現(xiàn)CD177在胃癌中表達(dá)上調(diào)，與本研究結(jié)果相似。CD177可作為腫瘤細(xì)胞黏附和遷移的調(diào)節(jié)因子[17]，使得絲氨酸蛋白酶3及CD177作為中樞將炎癥、血管組織壞死以及腫瘤的生長(zhǎng)侵襲互相聯(lián)系了起來(lái)。本研究發(fā)現(xiàn)PRTN3、CD177為上調(diào)的共同差異表達(dá)基因，有理由認(rèn)為PRTN3及CD177可能參與肺腺癌合并肺栓塞的發(fā)病過(guò)程。

本研究中最顯著的差異上調(diào)基因?yàn)镾100P。Tian等[18]用基因芯片分析鑒定了52個(gè)非小細(xì)胞肺癌的差異基因，發(fā)現(xiàn)S100P在NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中表達(dá)增強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致。此外，S100P的過(guò)表達(dá)增加了NSCLC細(xì)胞皮下轉(zhuǎn)移瘤的血管生成及促進(jìn)轉(zhuǎn)移[19]，提示S100P不僅能促進(jìn)NSCLC發(fā)生，還可能通過(guò)血管生成促進(jìn)肺栓塞的發(fā)生。

HP基因已被證明與肺癌相關(guān)[20]，其在腫瘤血管生成領(lǐng)域也發(fā)揮作用[21]。Zhang等[22]的研究發(fā)現(xiàn)HP在急性肺栓塞患者的血清和肺動(dòng)脈中表達(dá)上調(diào)，提示HP可能參與了急性肺栓塞的病理生理過(guò)程，可作為急性肺栓塞的潛在生物標(biāo)志物。因此，HP是探索肺腺癌合并肺栓塞患者生物學(xué)過(guò)程中一個(gè)可以考慮的方向。

本研究發(fā)現(xiàn)EPHA4在肺腺癌合并肺栓塞組中為顯著下調(diào)差異基因，EPHA4基因編碼Eph受體A4蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，EPHA4基因中/高表達(dá)的NSCLC患者生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于陰性/弱表達(dá)的NSCLC患者(P=0.019)[23]。Saintigny等[24]在肺腺癌亞組中，EPHA4的表達(dá)與患者總生存期呈正相關(guān)，提示其可能是一種腫瘤抑制因子，該研究中還發(fā)現(xiàn)EPHA4減少了細(xì)胞遷移和侵襲。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中EPHA4的缺失可以增加血管平滑肌細(xì)胞的收縮性，從而導(dǎo)致高血壓表型[25]，提示EPHA4對(duì)于血管內(nèi)皮有一定調(diào)控作用，而EPHA4是否在肺腺癌合并肺栓塞過(guò)程中起作用，需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了肺腺癌合并肺栓塞患者的差異表達(dá)基因(CD177、S100P、HP、EPHA4、PRTN3等)和肺腺癌合并肺栓塞患者差異表達(dá)基因富集的多條通路(代謝途徑、癌癥途徑、血小板活化等)。未來(lái)的研究將進(jìn)一步驗(yàn)證及探索這些基因在肺腺癌合并肺栓塞患者中的表達(dá)水平、肺腺癌合并肺栓塞發(fā)病過(guò)程中的生物學(xué)功能，以及參與的通路與肺腺癌合并肺栓塞發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)，以改善和提高肺腺癌合并肺栓塞的診斷和治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突