動靜脈血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測在肺癌診治中的意義及應(yīng)用

梁衛(wèi)娟 厲為良 高鵬帥 王亞旭

浙江大學(xué)明州醫(yī)院呼吸疾病診療中心，寧波 315000

肺癌已經(jīng)成為當(dāng)前主要的公共衛(wèi)生問題之一。根據(jù)鄭榮壽等[1]統(tǒng)計分析，2015年我國男性肺癌新發(fā)病例52萬，發(fā)病率73.90%(1/10萬)，居所有腫瘤首位，女性肺癌新發(fā)病例26.7萬，發(fā)病率39.78%(1/10萬)，居第二位；按死亡人數(shù)順位排序，2015年我國肺癌死亡人數(shù)約為63.1萬例，病死率為45.87%(1/10萬)居于我國惡性腫瘤死亡第1位。目前，盡管在癌癥治療方面取得了飛快進(jìn)展，但肺癌的總體5年生存率仍不到20%[2]。大多數(shù)肺癌患者確診時已處于晚期，導(dǎo)致了高病死率。CTCs檢測是一種新興的液體活檢技術(shù)，在腫瘤的早期診斷、個體化治療等方面有較廣泛的應(yīng)用，本文就CTCs簡要介紹、檢測技術(shù)、在肺癌中的應(yīng)用及其在動靜脈血中的差異等方面作如下綜述。

1 簡述CTCs及檢測

1.1 CTCs介紹 早在1869，澳大利亞學(xué)者Ashworth在轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中發(fā)現(xiàn)一種與原發(fā)腫瘤細(xì)胞基本相似的細(xì)胞，并提出了循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念[3]。CTCs來源于原發(fā)實體腫瘤或轉(zhuǎn)移灶，其主動或被動獲得脫離基底膜的能力，并侵入及通過組織基質(zhì)層，最后進(jìn)入血管。腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血循環(huán)后，大部分因機(jī)體的免疫監(jiān)控或血流剪切、氧化應(yīng)激、自身凋亡等原因在短期內(nèi)死亡，只有極少部分活性高、轉(zhuǎn)移潛性能強(qiáng)的CTCs能夠存活下來，進(jìn)而在遠(yuǎn)處靶器官中定植形成轉(zhuǎn)移灶[4]。CTCs是局部疾病的大使，在血液中以單個或成群的方式運(yùn)行，可在遠(yuǎn)處器官形成新的病變。此外，CTCs可能在轉(zhuǎn)移部位仍處于休眠狀態(tài)，并在稍后時間被激活，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)[5-6]。

循環(huán)腫瘤微栓子是數(shù)個細(xì)胞聚集成團(tuán)進(jìn)入血循環(huán)的團(tuán)塊。相比CTCs，它更能抵御“失巢凋亡”和免疫清除，有更強(qiáng)的生存優(yōu)勢，對細(xì)胞毒性藥物的耐受性也相對更強(qiáng)[7]。惡性腫瘤細(xì)胞為了獲得更強(qiáng)的侵襲和運(yùn)動能力，會丟失一些上皮細(xì)胞的表型，并通過某些特定程序獲得一些間質(zhì)細(xì)胞的表型，即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)。近年研究證據(jù)表明，多數(shù)惡性腫瘤脫離原發(fā)灶進(jìn)行轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)生了EMT，發(fā)生EMT的癌細(xì)胞會上調(diào)多種蛋白質(zhì)酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，提高自身侵襲性[8]。CTCs中也有EMT發(fā)生，造成上皮細(xì)胞特異性分子[上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，Ep CAM)、細(xì)胞角蛋白等]陰性表達(dá)，而間質(zhì)細(xì)胞特異性分子標(biāo)志物陽性率增加，這些細(xì)胞也具有更強(qiáng)的生存優(yōu)勢和轉(zhuǎn)移潛能[9]。循環(huán)腫瘤微栓子主要通過EMT轉(zhuǎn)化避免“失巢凋亡”，保持增殖能力。

CTCs與原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤分離、脫落，進(jìn)入患者血液，是相對容易獲得的腫瘤組織樣本。對CTCs的探索和研究可以為臨床提供大量的相關(guān)信息，反映疾病的實際、實時情況[10]。

1.2 CTCs檢測技術(shù) CTCs在血流中是非常罕見的，大約每1個CTC散落于數(shù)百萬(106～107)個正常單核白細(xì)胞之中[10-11]。因此，為了能夠研究和評估CTCs的數(shù)量和特征，其檢測方法需要有足夠強(qiáng)的敏感度及非常高的特異度。目前常用的肺癌CTCs檢測方法有以下幾種。

1.2.1 CellSearch技術(shù) CellSearch技術(shù)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床，也是多年來唯一被批準(zhǔn)的。它依賴于EpCAM在靶細(xì)胞表面的表達(dá)[12]，該上皮標(biāo)志物結(jié)合單克隆抗體(MAb)，通過抗原抗體反應(yīng)，使所有表達(dá)EpCAM的細(xì)胞都與與磁性珠結(jié)合，通過磁選從溶液中剔除。捕獲的細(xì)胞用細(xì)胞角蛋白(陽性檢測)、CD45(陰性檢測)和DAPI染色進(jìn)行成像[13]。迄今為止，該系統(tǒng)得到了廣泛應(yīng)用，并為其他CTCs分離技術(shù)的比較設(shè)定了標(biāo)準(zhǔn)。該試驗將每7.5 ml外周血中檢測到的5個CTCs切斷作為預(yù)測可行的指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，CellSearch技術(shù)是一種可行的預(yù)測乳腺、前列腺、非小細(xì)胞肺癌和其他上皮性腫瘤轉(zhuǎn)移、無進(jìn)展生存和整體存活的指標(biāo)[12]。該檢測技術(shù)的局限性主要在于敏感度低，無法檢測EpCAM陰性腫瘤細(xì)胞。

1.2.2 CTC-chip技術(shù) CTC-chip技術(shù)與CellSearch技術(shù)的基本原理相同。CTC-chip技術(shù)在其基礎(chǔ)之上，再利用微流體學(xué)原理，在硅片上設(shè)置了78 000個微柱位點。當(dāng)包含有Ep CAM抗原的CTCs流經(jīng)位點時，可以被位點捕獲，繼而再利用細(xì)胞免疫化學(xué)技能對其進(jìn)行檢測分析。這項技術(shù)的顯著優(yōu)點是不用預(yù)處理就能使用整個外周血，一旦細(xì)胞在微柱位點上被捕獲，就會被細(xì)胞角蛋白染色而變成可視化，以進(jìn)行計數(shù)[14]。

1.2.3 ISET聯(lián)合激光掃描細(xì)胞計數(shù)儀技術(shù) 此技術(shù)主要利用ISET富集原理，依據(jù)CTCs直徑與其他血細(xì)胞及淋巴細(xì)胞直徑的差異(CTCs直徑＞10μm，而紅細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞直徑＜8μm)，采用孔徑為8μm的濾膜過濾預(yù)先固定的外周血，分離出腫瘤細(xì)胞，然后對濾過膜進(jìn)行熒光標(biāo)記，最后對被熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞掃描計數(shù)。該方法的優(yōu)點是能有效捕獲有活力的腫瘤細(xì)胞，包括EpCAM陰性的腫瘤細(xì)胞；而且價格低廉、操作簡便。缺點是直徑較小的CTCs會被漏檢，而且缺乏形態(tài)學(xué)統(tǒng)一鑒定標(biāo)準(zhǔn)[15]。

1.2.4 免疫磁珠負(fù)向富集聯(lián)合受體靶向PCR檢測 葉酸受體是一種細(xì)胞表面受體糖蛋白，在多種癌癥(尤其是卵巢癌和肺癌)中高表達(dá)，已成為非小細(xì)胞肺癌患者重要的潛在藥物靶點[16]。除了CTCs或活化的單核細(xì)胞[17]外，在循環(huán)系統(tǒng)中沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)葉酸受體的細(xì)胞。

免疫磁珠負(fù)向富集聯(lián)合受體靶向PCR檢測技術(shù)利用負(fù)向富集的原理，通過帶有磁珠的CD45抗體、CD14抗體分別標(biāo)記白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，進(jìn)而分離去除這兩種細(xì)胞以負(fù)向富集CTCs。而后，在標(biāo)本內(nèi)加入腫瘤特異性葉酸受體-寡核苷酸耦合物探針標(biāo)記，最后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增分析。該技術(shù)的優(yōu)點是對EpCAM陰性的腫瘤細(xì)胞依然有效，同時也避免了漏診和假陽性，彌補(bǔ)了CellSearch技術(shù)、ISET技術(shù)的缺陷，目前已在肺癌檢測中開展并有較大收獲[18]。

1.2.5 陰性富集聯(lián)合熒光原位雜交技術(shù)檢測 利用白細(xì)胞表面抗原(如CD45)的特異性抗體與白細(xì)胞結(jié)合，將結(jié)合后的白細(xì)胞分離，從而分離出CTCs，稱為陰性富集。通過該方法篩選出的全部種類CTCs保留了其完整特性，有利于后續(xù)分析，但純度不夠。熒光原位雜交技術(shù)是利用標(biāo)記熒光素的核酸探針檢測CTCs，該技術(shù)的敏感度及特異度均更高。將差相富集法和腫瘤標(biāo)記免疫熒光染色與FISH結(jié)合，將會獲得一種更優(yōu)化的檢測方式，可不依賴腫瘤上皮細(xì)胞表面表達(dá)的相關(guān)標(biāo)志物，同時行腫瘤標(biāo)志物染色、染色體計數(shù)雙重計數(shù)。這種方法大大提高金額檢測的敏感度及特異度，但能否應(yīng)用于臨床，需更多的研究數(shù)據(jù)支撐[19]。

1.2.6 CTCs體外培養(yǎng) 雖然近年來CTCs檢測技術(shù)發(fā)展迅速，種類多樣，但各有優(yōu)缺點，在臨床應(yīng)用中未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。且其主要應(yīng)用局限于簡單的計數(shù)方面，不能鑒別各CTCs亞群，也不能明確具有活性的CTCs來自哪一個亞群。進(jìn)入外周血CTCs都部分或完全發(fā)生了EMT，如何對于這部分微量的CTCs進(jìn)行分子分析及相關(guān)功能研究面臨著艱難的技術(shù)挑戰(zhàn)。因此，對極少數(shù)目的侵襲和轉(zhuǎn)移活性的CTCs實現(xiàn)有效的體外擴(kuò)增可完成這一技術(shù)挑戰(zhàn)。有眾多學(xué)者致力于該技術(shù)的研究：Zhang等[20]采用微流體裝置捕獲早期肺癌患者CTCs，然后與成纖維細(xì)胞在三維基質(zhì)中原位共培養(yǎng)，但最終無法獲得純的CTCs；Yu等[21]通過CTC-Chip差相富集CTCs，并嘗試了多種的體外培養(yǎng)條件，成功有限。由此可見，雖然CTCs的體外培養(yǎng)在CTCs生物學(xué)特性研究、精確治療等方面前景廣闊，但技術(shù)上面臨諸多困難，大部分技術(shù)在樣本初處理、富集以及培養(yǎng)過程中都會對CTCs造成不可逆的損傷。

2 CTCs檢測對肺癌的臨床意義

2.1 肺癌的早期篩查及早期診斷 即使在腫瘤發(fā)展的早期階段，血液中也可以檢測到CTCs[22]，因此，它們可能成為癌癥篩查的手段之一。在健康人或良性腫瘤患者的血液中，被歸類為CTCs的細(xì)胞非常罕見。在肺癌方面，有學(xué)者試圖將CTCs評估與既定的篩選方法結(jié)合起來。He等[23]著重于提高低劑量CT篩查方案的特異性，將其與隨后的CTCs評估相結(jié)合，通過對比低劑量CT篩查已確定的肺“磨玻璃”結(jié)節(jié)患者和健康對照者的CTCs計數(shù)，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)肺結(jié)節(jié)患者的血液中有CTCs，但隨后的分子分析發(fā)現(xiàn)這些CTCs具有“惡性傾向”?？梢姡瑢⒌蛣┝緾T篩查方案與CTCs結(jié)合可以提高其特異性。還有一些學(xué)者對COPD患者的CTCs水平進(jìn)行了評估，在168例患者中有5例(3%)檢測出CTCs的患者都在4年內(nèi)罹患肺癌；此外，在監(jiān)測期內(nèi)無CTC陰性患者患上癌癥[24-25]。由此可見，CTCs檢測有助于肺癌的早期篩查、診斷和早期干預(yù)，提高治愈率及生存期。

2.2 肺癌分期、轉(zhuǎn)移及疾病進(jìn)展監(jiān)測 血行轉(zhuǎn)移是造成肺癌患者病情進(jìn)展、復(fù)發(fā)直至死亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，即便腫瘤直徑≤1 cm也可能發(fā)生轉(zhuǎn)移，而無臨床轉(zhuǎn)移病灶的早期肺癌患者，外周血中也可以檢測到CTCs[26]。雖然血液中檢測到CTCs就能判定患者一定發(fā)生了轉(zhuǎn)移，但很多研究顯示肺癌CTCs計數(shù)與腫瘤分期明顯相關(guān)[26-27]。CTCs計數(shù)和計數(shù)變化是評估癌癥是否進(jìn)展的基本但有效的指標(biāo)，CTCs計數(shù)已被證明是包括肺癌在內(nèi)的許多癌癥類型的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)[28]。CTCs計數(shù)是一種能夠?qū)崟r評估疾病發(fā)展的工具，相比臨床病理活檢具有創(chuàng)傷小、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點。術(shù)后或化療后CTCs計數(shù)的下降可能是疾病緩解的跡象；相反，CTCs計數(shù)的增加意味著疾病的進(jìn)展，需要重新評估，選擇新的治療方案[29]。

2.3 肺癌的個體化治療 臨床上腫瘤治療方案的選擇主要依據(jù)腫瘤的TNM分級和患者的綜合評分。目前，只有極少部分的早期患者可僅接受手術(shù)治療，其他絕大部分的中、晚期患者無論能否手術(shù)，均需接受其他治療(如化療、放療、分子靶向治療及免疫治療)或聯(lián)合治療。由于不能對原發(fā)腫瘤是否進(jìn)展或是否發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)行預(yù)估，故無法選擇合適的治療方案，從而延誤治療。CTCs計數(shù)和分子分型能夠精確地預(yù)測療效，判斷預(yù)后；同時，還可作為一種實時活檢工具，為肺癌的個體化治療提供更多、更精準(zhǔn)的依據(jù)[30]。多項研究表明，檢測患者外周血CTCs對評估化學(xué)治療、放射治療等多種不同肺癌治療方法均有意義[31-32]。此外，外周血CTCs檢測還可用于后續(xù)的腫瘤基因分析，為分子靶向治療提供一定依據(jù)[33]。

3 CTCs檢測應(yīng)用于臨床存在的問題

雖然很多研究證實CTCs在肺癌等腫瘤診療中應(yīng)用廣泛，但由于其在外周血中的稀有性，導(dǎo)致其檢測困難。目前已有眾多學(xué)者致力于多種檢測方法的研究，但由于標(biāo)準(zhǔn)范圍的難確定性，仍然只有CellSearch技術(shù)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床，因其敏感度及特異度不高，導(dǎo)致CTCs臨床推廣使用困難。原發(fā)腫瘤釋放數(shù)以萬計的腫瘤細(xì)胞入血，卻只有不到0.01%的CTCs能在外周血中存活并且形成轉(zhuǎn)移[34]。Allard等[35]利用CellSearch技術(shù)對99例肺癌樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)分別有20%、14%、10%、6%的外周血樣本中CTCs數(shù)目(個)≥2、≥5、≥10、≥50。Devriese等[36]用免疫磁珠負(fù)向富集法表明，46例非小細(xì)胞肺癌患者外周血中有21例(46%)存在CTCs，46例健康對照組中有3例(7%)可查到CTCs。在另一項研究中，Hofman等[37]以ISET富集法表明，外周血CTCs的存在與腫瘤的分期和腫瘤組織學(xué)無關(guān)。以上研究均說明，CTCs在患者外周靜脈血中的存在提供了一個不完整的、非常有限的信息，尚不足以在臨床中使用。

4 肺癌動靜脈CTCs含量及空間異質(zhì)性的機(jī)制探討

由于外周靜脈采血相對簡單且易被患者所接受，目前對CTCs的認(rèn)識大多來自外周靜脈血，這可能只是其循環(huán)過程中的一次快照，不能代表整個循環(huán)過程。有學(xué)者對73例原發(fā)性肝癌患者在腫瘤切除前分別從周圍靜脈、外周動脈、肝靜脈、下腔靜脈和門靜脈抽血檢測CTCs，數(shù)據(jù)表明CTCs在循環(huán)過程中其細(xì)胞分布和生物學(xué)特征存在著明顯空間異質(zhì)性，不同部位CTCs的測量有助于揭示肝癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移模式等[38]。為了證實血管中的高剪切應(yīng)力可能導(dǎo)致CTCs的EMT表型，這些學(xué)者還制作了一個微流控系統(tǒng)，研究動脈和靜脈剪切力對肝癌CTCs的影響，結(jié)果表明，在動脈剪切力條件下，EMT轉(zhuǎn)錄因子在5 min內(nèi)開始上調(diào)，與靜脈剪切力條件下相比，差異有顯著性(P＜0.05)，其他間充質(zhì)表型信號在動脈剪切力條件下循環(huán)30 min后開始增加，而上皮表型相關(guān)信號在循環(huán)30 min后開始下調(diào)。這些結(jié)果表明CTCs在通過動脈血管時即激活了EMT程序[38]。

Terai等[39]調(diào)查了17例葡萄膜黑色素瘤患者股總動脈和前肘靜脈配對血液標(biāo)本中CTCs的數(shù)量，CTCs采用標(biāo)準(zhǔn)CellSearch進(jìn)行分析，結(jié)果所有股總動脈標(biāo)本均檢出CTCs，而在同一患者的靜脈血標(biāo)本中，僅9/17(52.9%)可檢出CTCs，動脈血與外周靜脈血比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。以上研究表明，不同部位血管中CTCs分布不同；與動脈血相比，外周靜脈循環(huán)中的CTCs明顯下降，這意味著靜脈血標(biāo)本可能不是檢測患者CTCs的合適來源。由于腫瘤細(xì)胞在周圍靜脈系統(tǒng)循環(huán)時可能凋亡和碎裂[40]，導(dǎo)致外周靜脈血與動脈血中的CTCs不一樣，甚至更脆弱。

眾所周知，肺組織血供來源于體循環(huán)和肺循環(huán)，且生理狀態(tài)下肺循環(huán)占絕對優(yōu)勢。有研究證明肺癌分別接受體循環(huán)(支氣管動脈)及肺循環(huán)(肺動脈)的供血，肺循環(huán)供血在早期肺癌中尤其明顯[41]。由于肺癌獨特的肺靜脈引流的特點，肺靜脈中CTCs含量明顯提高，特別是在早期肺癌[42]。因此，肺靜脈CTCs檢測可以提高早期肺癌CTCs的檢測率。根據(jù)肺循環(huán)特點，肺靜脈中為動脈血，未經(jīng)肺循環(huán)系統(tǒng)的微循環(huán)經(jīng)過左心系統(tǒng)直接進(jìn)入體循環(huán)的外周動脈系統(tǒng)，因此，外周動脈血中CTCs含量應(yīng)接近肺靜脈血，而肺靜脈血抽取困難(需在手術(shù)中留樣)，臨床應(yīng)用受限。抽取外周動脈血方便、創(chuàng)傷小，更利于臨床應(yīng)用；而外周靜脈血要經(jīng)過體循環(huán)系統(tǒng)的微循環(huán)過濾，CTCs會有衰減。類似的是，經(jīng)支氣管靜脈入血的CTCs需經(jīng)過肺循環(huán)系統(tǒng)的微循環(huán)及體循環(huán)系統(tǒng)的微循環(huán)兩層過濾才能至外周靜脈，期間會伴有更明顯的CTCs衰減。根據(jù)以上研究及理論，推斷肺癌患者動脈血中CTCs含量可能會明顯高于靜脈血，而且動脈血中的CTCs也已經(jīng)發(fā)生了EMT，當(dāng)然這需要相關(guān)的研究去證實。

5 動靜脈中肺癌CTCs含量的臨床意義

CTCs的研究注重于CTCs計數(shù)和CTCs特征兩方面。CTCs計數(shù)是系統(tǒng)治療后的反應(yīng)標(biāo)志物之一，可早期發(fā)現(xiàn)患者的微轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)；而CTCs分子表征則有助于評估腫瘤異質(zhì)性，以檢測其耐藥性分布，明確藥物靶點。肺癌CTCs的研究是目前臨床研究的熱點之一，但是根據(jù)某些特定生物標(biāo)志物(如EpCAM)的CTCs研究發(fā)現(xiàn)，肺癌CTCs檢出率、檢出量與肝細(xì)胞癌、乳腺癌等其他癌癥相比均有下降[43]。CTCs數(shù)量取決于被檢血液樣本的容量和所應(yīng)用的技術(shù)，并最終影響各種統(tǒng)計結(jié)果的準(zhǔn)確性。靜脈采血是一種簡單、微創(chuàng)的方法，這種方法使許多癌癥患者都能很容易地接受CTCs檢測。由于一些CTCs在血液循環(huán)時可能被隔離或破壞，或由于技術(shù)原因可能在分析過程中丟失，導(dǎo)致外周靜脈CTCs的檢出率很低，限制了其在臨床中的推廣使用，所以在肺癌等腫瘤中，靜脈血CTCs的測定價值可能受限。前文已經(jīng)提到，在不同的血液來源中，CTCs的分布及異質(zhì)性也可能不同，肺癌動脈血中的CTCs含量可能大大高于靜脈血，其生物學(xué)特性與分子表達(dá)與靜脈血也不相同。而且動脈血中的CTCs受血液剪切力影響較小，受損較輕，更易于體外培養(yǎng)，如能通過研究證實，將大幅度提高CTCs檢測的敏感度，并能初步構(gòu)建肺癌患者CTCs時間和空間等分布模型，提高對CTCs異質(zhì)性的認(rèn)識，并了解其轉(zhuǎn)移機(jī)制，掌握其藥敏及耐藥性等，使其能在臨床上獲得更多、更廣泛地應(yīng)用，讓更多的肺癌等腫瘤患者獲得早期診斷及更有效的治療。

綜上所述，CTCs檢測在肺癌早期篩查診斷、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)評估、個體化治療等應(yīng)用方面得到進(jìn)展。雖然目前CTCs檢測方法多樣，但由于其在靜脈血中的稀有性限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用；研究對比動靜脈中肺癌CTCs差異性，有望打破這種局限性，使其獲得臨床上的廣泛應(yīng)用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突