放射性肺損傷機(jī)制及干細(xì)胞治療研究進(jìn)展

牛世英 楊彤 張?jiān)掠?/p>

山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250062

放射性肺損傷(radiation-induced lung injury，RILI)是對胸部的惡性腫瘤進(jìn)行放射治療引起的并發(fā)癥，最多見于對肺癌、乳腺癌的放療。在放療過程中可使病變周圍的肺組織因接受到超過其閾值的放射劑量導(dǎo)致產(chǎn)生不可逆性的損傷。RILI的輕重隨著放射劑量、放射部位和放射的范圍不同而有差異。大面積、高劑量的放療，RILI的發(fā)生率和嚴(yán)重程度大。RILI的病理變化包括兩個階段：早期的放射性肺炎和后期的放射性肺纖維化。雖然放療技術(shù)的有所發(fā)展，但接受胸部放射治療的患者仍有30%會發(fā)生RILI。RILI的發(fā)生涉及多種因素，現(xiàn)普遍認(rèn)為是射線導(dǎo)致Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷產(chǎn)生的多細(xì)胞因子級聯(lián)的結(jié)果，從而引起炎癥和纖維化。

1 RILI的機(jī)制

1.1 細(xì)胞損傷 當(dāng)肺暴露于射線時(shí)，首先出現(xiàn)的反應(yīng)就是細(xì)胞損傷，包括內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)，其完整性被破壞，隨后會有一系列細(xì)胞因子被釋放，以至于大量內(nèi)容物和炎性細(xì)胞集聚于肺泡腔，從而引起炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)的長期不斷刺激導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在生物體進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及系統(tǒng)發(fā)育中起著重要作用。同時(shí)，細(xì)胞凋亡也存在于病理情況下。有研究表明，射線引起RILI的過程中，細(xì)胞凋亡起著重要作用。以下是射線引起的幾種細(xì)胞的凋亡。

1.1.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞 血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管內(nèi)壁的單層扁平上皮，構(gòu)成了血管組織間屏障的重要成分，在血管生成、收縮與舒張中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞是輻射敏感細(xì)胞，照射劑量一旦超過其閾值，血管內(nèi)皮細(xì)胞便會發(fā)生損傷，最主要的結(jié)果就是凋亡反應(yīng)，之后便會引起細(xì)胞因子瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞和內(nèi)容物滲出，激發(fā)炎癥反應(yīng)；同時(shí)，炎性細(xì)胞和內(nèi)容物的不斷刺激導(dǎo)致纖維化形成[1]。并且射線導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，屏障功能受到破壞，血管通透性增強(qiáng)，大量的炎癥因子從受損細(xì)胞中釋放，從而引起炎癥反應(yīng)[2]。此外，當(dāng)肺部接受射線照射后，會引起氧自由基的產(chǎn)生[5]，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。因此血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在細(xì)胞損傷中起著重要作用。

1.1.2 肺泡上皮細(xì)胞 射線照射后，肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生損傷，主要是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而導(dǎo)致肺泡塌陷，促進(jìn)纖維化的發(fā)展。其次，研究發(fā)現(xiàn)，射線照射后，肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞中促凋亡基因Bax表達(dá)增加，凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)減少；同時(shí)間質(zhì)細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)增加，表明促凋亡基因和凋亡抑制基因的不平衡表達(dá)在肺纖維化過程中可能起重要的作用[3]。研究還發(fā)現(xiàn)，肺泡上皮細(xì)胞數(shù)量的減少導(dǎo)致成纖維細(xì)胞過度增生，從而發(fā)生纖維化；而且Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的凋亡也會影響Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞[4-6]。此外，最近的研究表明，肺泡上皮細(xì)胞可以通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過程轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并且肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT已在人類特發(fā)性肺纖維化和實(shí)驗(yàn)性肺纖維化中得到證實(shí)[7-8]。

1.2 肺泡巨噬細(xì)胞聚集 肺部接受射線照射可引起肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致的大量炎癥因子釋放，招募炎細(xì)胞聚集在損傷部位，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。同時(shí)，接受射線照射的肺泡巨噬細(xì)胞會引起活性氧的產(chǎn)生，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)化，引起炎癥反應(yīng)[9-10]。其次巨噬細(xì)胞也可通過釋放轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的激活，最終誘發(fā)肺纖維化[5]。

1.3 細(xì)胞因子釋放 細(xì)胞因子在RILI發(fā)生中倍受關(guān)注，受損細(xì)胞會釋放細(xì)胞因子和趨化因子，促進(jìn)炎性細(xì)胞遷移到受損部位，募集在受損部位的炎性細(xì)胞會分泌許多細(xì)胞因子，如IL-6、腫瘤壞死因子α、TGF-β1和IL-1α等。這些細(xì)胞因子在放射性肺炎和纖維化的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。

TGF-β1是與放射性肺纖維化發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的細(xì)胞因子，是一類具有調(diào)控細(xì)胞周期、早期發(fā)育、分化、免疫功能及誘導(dǎo)凋亡的多功能細(xì)胞因子。大量體內(nèi)體外試驗(yàn)證明TGF-β1在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用，其可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生凋亡[3，5]。在肺組織中，肺泡上皮細(xì)胞通過釋放TGF-β1導(dǎo)致纖維化發(fā)生，并且TGF-β1又可通過抑制巨噬細(xì)胞分泌的胰島素樣生長因子1來促使上皮細(xì)胞凋亡，從而加速纖維化的進(jìn)程。TGF-β1還參與成纖維細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，導(dǎo)致肺纖維化，同時(shí)參與EMT的誘導(dǎo)[12]。因此，TGF-β1在放射性纖維化發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。

IL-6是具有多種功能的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)急性炎性反應(yīng)。IL-6可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)照射區(qū)肺組織中的IL-6 m RNA水平明顯上調(diào)[13]。因此，IL-6參與了放射性肺炎的發(fā)生。

1.4 基底膜破壞 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetallo proteinases，MMPs)是一類蛋白水解酶，能特異的降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與了多種纖維化疾病的發(fā)展過程，其在放射性肺纖維化中的作用也引起人們的注意，尤其以MMP-2、MMP-9較重要。在RILI發(fā)生時(shí)，檢測到MMP-2、MMP-9的表達(dá)上調(diào)，兩者可以降解Ⅳ型膠原(基底膜的成分)，因此導(dǎo)致了基底膜破壞?；啄て茐目赡艽龠M(jìn)膠原蛋白的沉積，從而促進(jìn)了放射性肺炎向纖維化進(jìn)展。但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍然不清楚[8，14]。

1.5 氧化應(yīng)激 當(dāng)肺一旦暴露于射線下，就會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生氧自由基和活性氧。氧自由基是人體內(nèi)水產(chǎn)生的，具有很強(qiáng)的破壞性，可以破壞各種化學(xué)鍵和DNA雙鍵，是一種有害物質(zhì)。這些氧自由基和活性氧損害肺組織，尤其是上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，使細(xì)胞凋亡和上皮屏障功能破壞，導(dǎo)致RILI的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)證明，射線照射后肺內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧可以直接破壞蛋白質(zhì)并產(chǎn)生羥基自由基，進(jìn)而引起DNA損傷[15-16]。此外，活性氧可以破壞線粒體DNA并誘導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)[17-18]；還可導(dǎo)致細(xì)胞丟失，增加上皮細(xì)胞的血管通透性、蛋白質(zhì)滲出和細(xì)胞凋亡[5]。

2 干細(xì)胞治療

干細(xì)胞是具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞，是機(jī)體的起源細(xì)胞。而所謂干細(xì)胞治療，就是利用人體干細(xì)胞的分化和修復(fù)原理，把健康干細(xì)胞移植到患者體內(nèi)，以達(dá)到修復(fù)病變細(xì)胞和重建功能正常的細(xì)胞和組織的目的。目前，臨床上主要采用自體干細(xì)胞移植，無免疫排斥及交叉感染，是一種簡單、安全的治療方法。現(xiàn)就利用間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療RILI作一敘述。

2.1 概述 MSCs是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能，可誘導(dǎo)分化為脂肪、軟骨及其他組織類型細(xì)胞。MSCs可以接受移植，并且他們在部分組織中會遷移到病變部位分化為組織特異性功能的細(xì)胞，例如肺上皮細(xì)胞[19，21]，平滑肌細(xì)胞[20-21]。已有實(shí)驗(yàn)證明，MSCs利用細(xì)胞因子分泌與分化等特性修復(fù)損傷的組織器官[21-22]。

2.2 優(yōu)點(diǎn) MSCs的優(yōu)勢可概括為以下4個方面：(1)容易獲得；(2)可以歸巢并植入受損組織；(3)具有廣泛的增殖和分化能力；(4)免疫原性低。正因?yàn)檫@幾大優(yōu)勢，MSCs可以成功地跨越免疫屏障移植。越來越多的研究證明MSCs治療肺損傷存在2個主要優(yōu)點(diǎn)：(1)MSCs可以參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進(jìn)抗炎；(2)MSCs可以在全身給藥后遷移到損傷部位，它們中的一部分會分化成相應(yīng)的組織細(xì)胞以替代損傷的肺組織，促進(jìn)肺組織的修復(fù)[23]。先前MSCs與輻射肺活檢組織共培養(yǎng)的體外實(shí)驗(yàn)證明了MSCs可以分化為上皮細(xì)胞的能力，雖然MSCs具有分化的能力，但它們在組織中很快被免疫系統(tǒng)清除，且可以通過分泌細(xì)胞因子來促進(jìn)組織修復(fù)[24]。

2.3 用于治療RILI的MSCs分類及其治療機(jī)制

2.3.1 骨髓MSCs治療RILI的機(jī)制 骨髓MSCs是骨髓內(nèi)存在的一類非造血干細(xì)胞，其在體內(nèi)外具有支持和調(diào)控造血的作用，并且在體內(nèi)可分布于多種組織和器官，具有多向分化潛能，因此目前其在醫(yī)學(xué)上難以攻克的一些疾病方面具有重大應(yīng)用潛力。骨髓MSCs在治療RILI中可能存在的機(jī)制有以下幾點(diǎn)。(1)具有抗輻射特性。有學(xué)者在小鼠組織中研究了骨髓MSCs對輻射的反應(yīng)，骨髓MSCs具有更高的體外存活率和抗輻射能力[21]。骨髓MSCs通過產(chǎn)生抗氧化酶(如超氧化物歧化酶1、3，錳超氧化物歧化酶)降低氧化應(yīng)激和活性氧水平，保護(hù)肺免受輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷。此外，有實(shí)驗(yàn)證明骨髓MSCs在缺氧條件下抗輻射特性更加顯著[25]。(2)具有高效的修復(fù)系統(tǒng)。電離輻射可導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂直接破壞DNA結(jié)構(gòu)，也可通過產(chǎn)生活性氧間接影響基因組DNA和線粒體DNA結(jié)構(gòu)，損害DNA分子[26]。因此，放射治療會導(dǎo)致不同形式的DNA損傷。其中最嚴(yán)重的是DNA雙鏈斷裂。研究表明，骨髓MSCs具有高效的DNA雙鏈損傷修復(fù)系統(tǒng)[20，27]。(3)抑制上皮細(xì)胞EMT。先前有文獻(xiàn)報(bào)道，存在于腫瘤環(huán)境中的MSCs可以促進(jìn)癌細(xì)胞EMT[28]，例如乳腺癌[29]、胃癌[30]。一些MSCs整合到腫瘤中時(shí)受腫瘤微環(huán)境的影響，會轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)MSCs，腫瘤相關(guān)MSCs會通過微環(huán)境的調(diào)節(jié)顯示出更強(qiáng)的腫瘤促進(jìn)能力，并且通過微環(huán)境中的分泌因子促進(jìn)癌細(xì)胞EMT[28]。然而在炎癥病灶中，MSCs通過旁分泌刺激對鄰近細(xì)胞顯示出有益的作用[20]。有研究報(bào)道，受傷的肺組織保留了骨髓MSCs在肺中的滯留，且骨髓MSCs能夠在肺中分泌多種細(xì)胞因子，通過上調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)減輕局部損傷，刺激上皮細(xì)胞增殖，抑制上皮細(xì)胞EMT[23，25，31]。而且骨髓MSCs可釋放高水平的生長因子，如VEGF，有利于傷口的愈合[23]。(4)下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2的表達(dá)。Klein等[32]發(fā)現(xiàn)電離輻射后引起內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2表達(dá)上調(diào)，破壞血管結(jié)構(gòu)，而MSCs可以減少內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2表達(dá)水平，使血管功能正?；?，減輕血管結(jié)構(gòu)的破壞。

2.3.2 人臍帶MSCs治療RILI的機(jī)制 臍帶在臨床上屬于醫(yī)療廢物，來源廣泛，取材方便，分化潛力大，增殖能力強(qiáng)，具有明顯的優(yōu)勢。人臍帶MSCs能抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，同時(shí)能減輕肝纖維化和腎損傷[33-34]。而其在治療RILI中可能存在的機(jī)制有以下幾點(diǎn)。(1)降低IL-1的水平。在發(fā)生RILI時(shí)IL-1、TGF-β1等短暫升高已在小鼠模型中證實(shí)，并且IL-1有促進(jìn)炎癥和纖維化的作用，可加重病情[23]。有研究證明，人臍帶MSCs能抑制單核巨噬細(xì)胞分泌IL-1，降低IL-1的水平可以減輕RILI的進(jìn)展[35]。但MSCs抑制IL-1分泌的機(jī)制還不清楚。(2)合成IL-10。IL-10是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的體內(nèi)強(qiáng)有力的抗炎因子，它能抑制巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的活性，抑制Th1反應(yīng)，并促進(jìn)抗炎分子的分泌，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肺組織的修復(fù)，減輕RILI的進(jìn)展[25，36]。人臍帶MSCs進(jìn)入體內(nèi)可以合成和分泌IL-10，提高抗炎因子的水平。然而，IL-10也是最有爭議的細(xì)胞因子，關(guān)于其在MSCs中的分泌存在矛盾的結(jié)果[21]。(3)抑制肺泡上皮細(xì)胞EMT。Wnt信號通路在細(xì)胞分化和增殖中起著至關(guān)重要的作用，TGF-β1和Wnt信號通路之間的協(xié)同作用可以誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞經(jīng)歷EMT[35]。Zhang等[37]進(jìn)一步研究了人臍帶來源的MSCs和Wnt通路之間的聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)正常的肺成纖維細(xì)胞與臍帶來源的MSCs的共培養(yǎng)削弱了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號的激活，并且張春陽等[38]通過研究也發(fā)現(xiàn)MSCs可抑制放射線照射后小鼠肺組織內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路的活化。因此Wnt/β-連環(huán)蛋白信號成為了減弱RILI的潛在治療靶點(diǎn)。

2.3.3 人脂肪MSCs治療RILI的機(jī)制 人脂肪MSCs通過分泌前列腺素E2(prostagandin E2，PGE2)和肝細(xì)胞生長 因 子(hematopoietic growth factor，HGF)下 調(diào)TGF-β1

[25]。人脂肪MSCs分泌的HGF可能通過結(jié)合c-Met增加細(xì)胞內(nèi)Smad7的水平，并通過以PI3K/Akt/p70依賴的方式上調(diào)損傷部位MMP-1、MMP-3和MMP-9的表達(dá)，從而促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的凋亡，抑制EMT[23]。Dong等[39]也觀察到人脂肪MSCs可以通過分泌HGF來保護(hù)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞免受輻射誘導(dǎo)的EMT。人脂肪MSCs分泌的PGE2可促進(jìn)抗炎因子IL-10的產(chǎn)生。此外，PGE2可抑制TGF-β1誘導(dǎo)活化的成纖維細(xì)胞增殖，并且PGE2還通過增加阻斷PI3K/Akt信號通路的PTEN蛋白活性誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)表明，人脂肪MSCs通過激活抗炎通路和旁分泌因子的方式抑制纖維化[23，40]。

Jiang等[40]發(fā)現(xiàn)，人脂肪MSCs可以降低血清IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子α水平，下調(diào)照射肺組織中TGF-β1和1型膠原水平來緩解RILI。

3 小結(jié)與展望

RILI是多因素造成的結(jié)果，表現(xiàn)為照射后引起多種靶細(xì)胞損傷，細(xì)胞損傷后立即引起細(xì)胞因子釋放、氧化應(yīng)激等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。MSCs取材簡單，分化潛能大，增殖能力強(qiáng)，免疫原性低，可作為靶向細(xì)胞應(yīng)用于臨床，是治療RILI的重要部分。

雖然MSCs已經(jīng)被越來越多的用于許多疾病的治療，但其用于RILI的具體機(jī)制還不是很清楚，MSCs治療后主要表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)降低，纖維化緩解。然而，MSCs也可能促進(jìn)組織纖維化。在輻射后立即注入肺中的MSCs會分化為功能性的肺細(xì)胞，但在輻射后后期再注入就可能參與纖維化的發(fā)展，推測與后期微環(huán)境改變和TGF-β1水平升高有關(guān)[41]。因此，MSCs治療RILI的時(shí)間窗也是至關(guān)重要的。

值得注意的是，無癥狀的放射性肺炎的RILI通常在嚴(yán)重纖維化發(fā)展的晚期被診斷出來，這可能很難用MSCs有效逆轉(zhuǎn)。因此，基于MSCs的RILI治療的潛在臨床應(yīng)用仍有很長的路要走。就RILI而言，我們?nèi)匀恍枰u估MSCs治療的安全性、最佳劑量、給藥時(shí)間和給藥途徑。此外，MSCs在實(shí)驗(yàn)動物中的治療效果并不總是顯示出令人滿意的結(jié)果，因此還需要大量的實(shí)驗(yàn)去探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突