蒲公英酸奶對(duì)小鼠體液免疫的影響

孫立陽 霍文達(dá) 王兆蘭 張靈智 孫晴

【摘要】 目的：通過比較蒲公英酸奶、蒲公英黃酮酸奶和蒲公英黃酮汁對(duì)小鼠體液免疫指標(biāo)的測(cè)定，探索蒲公英酸奶對(duì)小鼠體液免疫的影響。方法：首先以超聲法從蒲公英中提取黃酮，并制備蒲公英黃酮酸奶。選取體重相近小鼠，隨機(jī)分為四組，每組10只，常規(guī)飼養(yǎng)。各組分別每天早、晚各灌胃一次（0.5 mL/只）：一組生理鹽水（空白對(duì)照組）、二組蒲公英酸奶（蒲公英酸奶組）、三組蒲公英黃酮酸奶（蒲公英黃酮酸奶組）、四組蒲公英黃酮汁（蒲公英黃酮汁組），連續(xù)灌胃4周。第5周取小鼠進(jìn)行胸腺、脾臟免疫器官指數(shù)測(cè)定、溶菌酶試驗(yàn)和小鼠抗體生成細(xì)胞水平測(cè)定其體液免疫功能。結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，其他三組免疫器官指數(shù)均升高（P<0.05），溶菌作用均顯著增強(qiáng)（P<0.01），溶血素含量、溶血空斑數(shù)均顯著增多（P<0.01）;但蒲公英黃酮酸奶組和蒲公英酸奶組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與蒲公英黃酮汁組比較，蒲公英酸奶組的溶菌作用顯著增強(qiáng)（P<0.05），溶血素含量、溶血空斑數(shù)均顯著增多（P<0.05）。結(jié)論：蒲公英酸奶可明顯提高小鼠體液免疫功能，且與蒲公英黃酮酸奶效果相當(dāng)，該結(jié)果為蒲公英產(chǎn)品的開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支撐。

【關(guān)鍵詞】 蒲公英酸奶 體液免疫 溶菌酶 溶血素

Effects of Dandelion Yogurt on Humoral Immune in Mice/SUN Liyang， HUO Wenda， WANG Zhaolan， ZHANG Lingzhi， SUN Qing. //Medical Innovation of China， 2021， 18（14）： 0-014

[Abstract] Objective： By comparing the effects of dandelion yogurt， dandelion flavone yogurt and dandelion flavone juice on humoral immunity in mice， to explore the effect of dandelion yoghurt on humoral immunity in mice. Method： Firstly， flavonoids were extracted from dandelion by ultrasonic method， and dandelion flavonoid yogurt was prepared. Mice with similar body weights were selected and randomly divided into four groups， 10 mice in each group， and they were reared routinely. Each groups were given intragastric administration once in the morning and evening （0.5 mL/head）： the first group of physiological saline （blank control group）， the second group of dandelion yogurt （dandelion yogurt group）， the third group of dandelion flavone yogurt （dandelion flavone yogurt group）， the fourth group of dandelion flavonoid juice （dandelion flavonoid juice group） were given intragastrically for 4 weeks. In the 5th week， mice were taken for thymus and spleen immune organ index determination， lysozyme test， and mouse antibody-producing cell level to determine their humoral immune function. Result： Compared with the blank control group， the immune organ index of the other three groups were increased （P<0.05）， the bacteriolytic effect were significantly enhanced （P<0.01）， the content of hemolysin， and the number of hemolytic plaques were significantly increased （P<0.01）; but there was no significant difference between the dandelion flavone yogurt group and the dandelion yogurt group （P>0.05）; compared with the dandelion flavone juice group， the bacteriolytic effect of the dandelion yogurt group was significantly enhanced （P<0.05）， hemolysin content， the number of hemolysis plaques were significantly increased （P<0.05）. Conclusion： Dandelion yogurt can significantly improve humoral immune function in mice， and its effect is similar to that of dandelion flavonoid yogurt. The result lays foundation for the development of dandelion products.

[Key words] Dandelion yogurt Humoral immune Lysozyme Hemolysin

First-authors address： School of Pharmacy， Linyi University， Linyi 276000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.14.003

蒲公英因其很高的營(yíng)養(yǎng)及醫(yī)療價(jià)值，被國(guó)家衛(wèi)生部收入藥食同源目錄，其應(yīng)用開發(fā)情況也一直備受關(guān)注[1-4]。許多研究證實(shí)蒲公英提取物中的黃酮類化合物能參與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一系列酶系統(tǒng)，這些酶系統(tǒng)中包含一系列的反應(yīng)，如血小板凝聚、消炎、抗氧化、清除自由基、防治糖尿病并發(fā)癥等作用，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效[5-8]。孫珊珊等[9]報(bào)道：“蒲公英總黃酮能提高小鼠體液免疫功能”。酸奶可以激活全身的免疫系統(tǒng)功能，抑制腫瘤。與普通牛奶相比，其中的蛋白質(zhì)更易吸收，發(fā)酵后產(chǎn)生的乳酸還能抑制有害微生物的繁殖，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)和消化液的分泌，提高多種礦物質(zhì)的吸收率，從而提高人體免疫力。蒲公英酸奶是蒲公英和純牛奶經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成的微生態(tài)制劑，風(fēng)味清新獨(dú)特，是一種集營(yíng)養(yǎng)、保健、爽口于一體的新型乳制品，具有較高的推廣價(jià)值[10-13]。因此，本課題在以往研究基礎(chǔ)上優(yōu)化蒲公英酸奶的制作工藝流程，進(jìn)一步探究其對(duì)小鼠體液免疫功能的調(diào)節(jié)作用，希望可以得出蒲公英酸奶能更好提高小鼠的體液免疫功能。而且，在全球特醫(yī)產(chǎn)品快速崛起的大潮下為中藥材資源的開發(fā)和深加工開辟了一條新的途徑，且為開發(fā)、深入研究蒲公英奶制品及其功能提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇同批次的KM小鼠，體重（20±5）g，雌雄兼用;新西蘭家兔2只，體重（2.0±0.5）kg;豚鼠4只，體重（200±20）g。以上動(dòng)物均采購(gòu)于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。小鼠基礎(chǔ)飼料、兔飼料均購(gòu)自南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 藥品與試劑 蒲公英采自臨大校園（采集時(shí)間2019年3月3日-6月1日，每10天采集1次），洗凈，50 ℃烘干，粉碎過40目篩備用。蘆丁對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y05 M6S1）、乳酸菌（北京川秀科技有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：Q/TZCXG 0001）、伊利純牛奶（購(gòu)自超市）、金黃色葡萄球菌（微生物實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.1.3 儀器 KQ-300DE型數(shù)控超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、UV-4802型紫外可見分光光度計(jì)[尤尼科（上海）儀器有限公司]、DR-3000系列酶標(biāo)分析儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 蒲公英黃酮的提取和含量測(cè)定 稱量蒲公英粉末240 g，加入70%乙醇150 mL浸泡30 min后，在60 ℃ 80 kHz的頻率下超聲提取3次，20 min/次，冷卻后抽濾合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得提取浸膏。

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取在120 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100 mg于100 mL容量瓶中，量取甲醇10 mL使之溶解，加蒸餾水定容至刻度線，精密吸取1 mL置10 mL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.10 mg/mL）。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，按文獻(xiàn)[4]方法顯色。加蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm處測(cè)定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1?；貧w方程：Y=0.947 4X+0.001 6，r=0.997 9，在0.005～0.05范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.1.3 供試品溶液的制備 將混合超聲提取液于80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min得黃酮浸膏24 mL，放冷。取已得到的浸膏0.02 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，得供試品溶液。

1.2.1.4 供試品含量測(cè)定 取五份供試品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，按1.2.1.2方法顯色加蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm處測(cè)定吸光度。代入回歸方程，得結(jié)果。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及小鼠飼養(yǎng) 取40只小鼠，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組分蒲公英酸奶組、蒲公英黃酮酸奶組、蒲公英黃酮汁組三組，空白對(duì)照組為生理鹽水。早晚各組分別灌胃0.5 mL各組試劑。1次/d，持續(xù)30 d。常規(guī)飼料、自來水飼養(yǎng)。（1）空白對(duì)照組：生理鹽水。（2）蒲公英酸奶組：稱量藥材粉末100 g，加水煮沸，濃縮成10 mL蒲公英汁，過濾放涼，備用。蒲公英汁10 mL→牛奶240 mL→1‰接種菌種→裝杯→發(fā)酵（43 ℃，6～8 h）→成熟（6～8 ℃，24 h） →檢驗(yàn)→蒲公英酸奶，備用灌胃。（3）蒲公英黃酮酸奶組：蒲公英黃酮膏10 mL→牛奶240 mL→1‰接種菌種→裝杯→發(fā)酵（43 ℃，6～8 h）→成熟（6～8 ℃，24 h）→檢驗(yàn)→蒲公英黃酮酸奶，備用灌胃。（4）蒲公英黃酮汁組：取10 mL黃酮浸膏，加240 mL水稀釋，得黃酮汁，備用灌胃。

1.2.3 免疫器官指數(shù)測(cè)定 小鼠飼喂4周后摘眼球采血，分離血清，收集備用。然后脫臼處死小鼠解剖，取脾臟和胸腺，觀察病理變化，稱重計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)（mg/g）=臟器重量（mg）/體重（g）。

1.2.4 溶菌酶的溶菌作用 首先制備含金黃色葡萄球菌的瓊脂平板，用無菌打孔器在平板上打孔，用移液槍吸取新鮮收集的血清加入瓊脂孔內(nèi)，每孔加滿，同時(shí)加雞蛋清作陽性對(duì)照組，生理鹽水做陰性對(duì)照組;置37 ℃下18～24 h觀察結(jié)果[14]。觀察各孔周圍溶菌情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量溶菌環(huán)直徑。

1.2.5 溶血素測(cè)定法測(cè)定小鼠體液免疫功能

1.2.5.1 兔血紅細(xì)胞懸液的制備 家兔心臟采血10 mL，4 000 r/min離心5 min，棄上清液;加與沉淀等量的生理鹽水，4 000 r/min離心5 min，棄上清液;4 000 r/min離心10 min，棄上清液，清洗2次得兔血紅細(xì)胞。用生理鹽水1︰5稀釋，得兔血紅細(xì)胞懸液，調(diào)整兔血紅細(xì)胞數(shù)為2×109個(gè)/mL，測(cè)定小鼠體液免疫功能時(shí)用作抗原。

1.2.5.2 補(bǔ)體的制備 取豚鼠心臟血10 mL，4 000 r/min離心10 min，取上清，用生理鹽水稀釋，置于4 ℃冰箱中備用，調(diào)整補(bǔ)體數(shù)為1.00×107個(gè)/mL，測(cè)定小鼠體液免疫功能時(shí)用作補(bǔ)體。

1.2.5.3 小鼠血清分離 對(duì)飼喂后的每只小鼠腹腔注射0.2 mL兔血紅細(xì)胞懸液，繼續(xù)喂養(yǎng)4 d。于第5天眼球取血，處理樣品，2 000 r/min離心10 min，取上層血清，用生理鹽水稀釋500倍。

1.2.5.4 小鼠血清溶血素含量測(cè)定 取1 mL已稀釋好的血清置于試管中，加入兔血紅細(xì)胞懸液0.5 mL，將試管置于冰浴中冷卻，向試管中加入補(bǔ)體1 mL，再將其移至37 ℃恒溫水浴中，保溫10 min，隨即放置于冰浴中。2 000 r/min離心10 min，取上清液，酶標(biāo)儀測(cè)其吸收度。經(jīng)兔紅細(xì)胞免疫后的小鼠，可產(chǎn)生兔紅細(xì)胞抗體即溶血素，血清溶血素含量以半數(shù)溶血值（HC50）表示。計(jì)算公式如下式即抗體含量：HC50=（樣品吸收度值/兔紅細(xì)胞溶液半數(shù)溶血時(shí)的吸收度值）×稀釋倍數(shù)。

1.2.6 小鼠血清溶血空斑試驗(yàn) 以2×109個(gè)/mL兔紅細(xì)胞免疫小鼠，4 d后取出免疫和對(duì)照小鼠的脾。稱重后用Hanks洗滌并置含冷Hanks的培養(yǎng)皿中，用針頭沖洗脾臟直至變?yōu)榘咨?，然后將?xì)胞液收集于刻度離心管中（將試管置冰浴中）。用Hanks懸浮細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度到2×106/mL脾細(xì)胞懸液，備用。在表層瓊脂中加入牛胎血清、右旋糖酐、20%兔紅細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液各0.1 mL，然后傾注入鋪有底層基的載玻片上，凝固后于37 ℃孵育1 h。然后加1 mL補(bǔ)體，再次孵育30 min。用顯微鏡觀察溶血空斑，并計(jì)數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo) 小鼠免疫器官胸腺、脾臟指數(shù)、溶菌酶的溶菌作用、溶血素含量、溶血空斑數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英黃酮提取及含量測(cè)定 利用超聲提取蒲公英黃酮。用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取液吸光度測(cè)定，帶入回歸方程計(jì)算結(jié)果，見表1。

2.2 小鼠免疫器官指數(shù)測(cè)定 蒲公英酸奶組、蒲公英黃酮酸奶組、蒲公英黃酮汁組臟器指數(shù)均顯著高于空白對(duì)照組（胸腺：t=3.621 0、3.104 0、2.835 0，P=0.002 0、0.006 1、0.011 0;脾臟：t=3.449 0、2.895 0、2.886 0，P=0.002 9、0.009 7、0.009 8）;但蒲公英酸奶組與蒲公英黃酮酸奶組臟器指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（胸腺：t=0.372 7，P=0.713 7;脾臟：t=0.359 8，P=0.713 7）;蒲公英酸奶組臟器指數(shù)與蒲公英黃酮汁組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（胸腺：t=0.629 8，P=0.536 7;脾臟：t=0.416 0，P=0.682 3）。見表2和圖2。

2.3 小鼠體液溶菌酶的溶菌作用 四組小鼠溶菌酶溶菌作用的溶菌環(huán)：空白對(duì)照組為（1.50±0.32）cm、

蒲公英酸奶組為（2.30±0.31）cm、蒲公英黃酮酸奶組（2.20±0.22）cm、蒲公英黃酮汁組為（2.00±0.10）cm、陽性對(duì)照組為（2.40±0.30）cm、陰性對(duì)照組無溶菌環(huán)出現(xiàn)，蒲公英酸奶組的溶菌環(huán)最大。蒲公英酸奶組、蒲公英黃酮酸奶組、蒲公英黃酮汁組的溶菌作用與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.683 0、5.647 0、4.368 0，P=0.000 1、0.000 1、0.000 4）;蒲公英黃酮酸奶組與蒲公英酸奶組溶菌作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.849 0，P=0.407 1）;蒲公英酸奶組溶菌作用顯著高于蒲公英黃酮汁組（t=2.773 0，P=0.012 5）。見圖3。

2.4 小鼠抗體生成細(xì)胞水平測(cè)定

2.4.1 小鼠溶血素含量的測(cè)定 四組小鼠溶血素：空白對(duì)照組為（284.18±27.40），蒲公英酸奶組為（359.01±34.50），蒲公英黃酮酸奶組為（349.78±33.77），蒲公英黃酮汁組為（324.18±34.55），蒲公英酸奶組的溶血素含量最高。蒲公英酸奶組、蒲公英黃酮酸奶組、蒲公英黃酮汁組溶血素含量與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.372 0、4.770 0、2.868 0，P=0.000 1、

0.000 2、0.009 6）;但蒲公英黃酮酸奶組與蒲公英酸奶組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.605 0，P=0.552 8）;蒲公英酸奶組溶血素含量顯著高于蒲公英黃酮汁組（t=2.256 0，P=0.036 7）。見圖4。

2.4.2 小鼠溶血空斑數(shù)測(cè)定 四組小鼠溶血空斑數(shù)量：空白對(duì)照組為（80.71±5.37）個(gè)/106脾細(xì)胞，蒲公英酸奶組為（204.88±8.47）個(gè)/106脾細(xì)胞，蒲公英黃酮酸奶組為（203.34±5.87）個(gè)/106脾細(xì)胞，蒲公英黃酮汁組為（198.64±3.47）個(gè)/106脾細(xì)胞，蒲公英酸奶組的溶血空斑個(gè)數(shù)最多。蒲公英酸奶組、蒲公英黃酮酸奶組、蒲公英黃酮汁組的溶菌作用與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=39.260 0、48.748 0、58.322 0，P=0.000 1、0.000 1、0.000 1）。蒲公英黃酮酸奶組與蒲公英酸奶組溶菌作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.473 0，P=0.642 2）;蒲公英酸奶組顯著高于蒲公英黃酮汁組（t=2.155 0，P=0.044 9）。見圖5。

3 討論

本研究結(jié)果顯示：無論是蒲公英、黃酮還是復(fù)合發(fā)酵的微生態(tài)制劑對(duì)小鼠的體液免疫功能均有提高作用，復(fù)合型酸奶作用更顯著，但從蒲公英中提取黃酮做酸奶和直接水浸蒲公英酸奶在提高小鼠體液免疫功能上差異不顯著。孫珊珊等[9]報(bào)道蒲公英根、葉、花總黃酮均有增強(qiáng)小鼠體液免疫功能的作用，其中花的作用最強(qiáng)。筆者也做了蒲公英不同部位黃酮提取，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道結(jié)果基本吻合，但花的數(shù)量是有限的，限制了黃酮的大量需求，所以結(jié)合后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難看出不用單獨(dú)提取黃酮，直接用蒲公英濃縮汁做酸奶效果相當(dāng)，這樣既省時(shí)省力、節(jié)約成本，又不失蒲公英的其他營(yíng)養(yǎng)成分，該結(jié)果為蒲公英產(chǎn)品的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

機(jī)體免疫由特異性免疫和非特異性免疫組成。胸腺和脾臟為體內(nèi)主要的免疫器官，與體液免疫和細(xì)胞免疫均有密切關(guān)系，而T、B淋巴細(xì)胞是反映機(jī)體特異性免疫功能最重要的標(biāo)志。而由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫功能主要由存在于血液、分泌液與組織液等大量體液中的抗體、補(bǔ)體、溶菌酶、細(xì)胞因子來完成[15-16]。本實(shí)驗(yàn)通過免疫器官指數(shù)、血清溶菌酶抑菌圈測(cè)定和以溶血空斑計(jì)數(shù)、溶血素法HC50觀測(cè)蒲公英、黃酮、乳酸菌、蒲公英酸奶對(duì)小鼠體液免疫功能的影響，且是以兔紅細(xì)胞代替綿陽紅細(xì)胞[17]。由于時(shí)間和經(jīng)費(fèi)的限制對(duì)小鼠體液免疫功能的檢測(cè)項(xiàng)目還不夠全面，缺少對(duì)免疫細(xì)胞因子的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在飼養(yǎng)過程中偶爾有死亡造成樣本的不足，所以在實(shí)驗(yàn)操作方法和研究范圍上還需深入細(xì)致全面的探究。

蒲公英是集藥用、食用、化工用途等多種功用于一體的天然植物，目前對(duì)其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)空間還相對(duì)較大，對(duì)其新產(chǎn)品定位、質(zhì)量控制均有很大的提升空間。為使這一豐富的資源得到充分利用，有必要從技術(shù)創(chuàng)新上實(shí)現(xiàn)對(duì)其產(chǎn)品的深入研發(fā)。蒲公英種類繁多，鑒于自然資源的豐富性，對(duì)其他品種利用和開發(fā)工作也有待展開，以期這一味藥食同源的傳統(tǒng)藥材能為人類健康做更好的服務(wù)。

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（收稿日期：2020-08-11） （本文編輯：程旭然）